Para ayudar a evaluar los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración hepática biliar del pez cebra, establecimos un modelo de lesión hepática en el que los hepatocitos que expresan nitroreductasa se ablacionan genéticamente tras el tratamiento con metronidazol. En este protocolo, describimos cómo manipular, monitorizar y analizar hábilmente la ablación de hepatocitos y la regeneración hepática impulsada por la biliar.
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Artículo de método
Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática
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Resumen
Resumen
El hígado tiene una gran capacidad de regeneración. Los hepatocitos, las células parenquimatosas del hígado, se puede regenerar en una de dos maneras: la regeneración del hígado hepatocyte- o biliar impulsada. En la regeneración de los hepatocitos del hígado impulsada, los hepatocitos en regeneración se derivan de hepatocitos preexistentes, mientras que, en la regeneración biliar impulsada, los hepatocitos en regeneración se derivan de las células epiteliales biliares (BEC). Para la regeneración del hígado hepatocitos impulsada, hay excelentes modelos de roedores que han contribuido de manera significativa a la comprensión actual de la regeneración del hígado. Sin embargo, no existe tal modelo de roedores para la regeneración hepática biliar impulsada. Recientemente hemos informado en un modelo de lesión hepática pez cebra en el que las BEC ampliamente dan lugar a hepatocitos en caso de pérdida de hepatocitos grave. En este modelo, los hepatocitos se ablación específicamente por un medio de farmacogenéticos. Aquí presentamos en detalle los métodos para la ablación de los hepatocitos y analizar el proceso de regeneración del hígado impulsado por la BEC.Este modelo de ablación específico de hepatocitos se puede utilizar más para descubrir los mecanismos moleculares y celulares subyacentes de la regeneración hepática biliar impulsada. Además, estos métodos pueden ser aplicados a las pantallas químicos para identificar pequeñas moléculas que aumentan o inhiben la regeneración del hígado.
Introducción
El hígado es un órgano altamente regenerativa. Durante la regeneración del hígado, la regeneración de los hepatocitos, las células del parénquima del hígado, se derivan de los hepatocitos preexistentes (regeneración hepática hepatocitos impulsada) o BEC (regeneración hepática biliar impulsada) 1,2. La lesión hepática por lo general provoca la proliferación de los hepatocitos preexistentes; sin embargo, cuando se ve comprometida la proliferación de hepatocitos, las BEC puede contribuir a los hepatocitos 2-4. Estos dos modos de regeneración del hígado son clínicamente significativos. Tras la eliminación quirúrgica de una porción del hígado humano ....
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Protocolo
El pez cebra se plantearon y criado de acuerdo con el procedimiento estándar; experimentos fueron aprobados por la Universidad de Pittsburgh Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
1. Preparación de embriones / larvas
- Para llevar a cabo apareamientos cronometrados, creado varón adulto y hembra Tg (fabp10a: PPC-NTR) S931 peces hemizygous o homocigotos S / N y colocar un divisor entre ellos. Eliminar este divisor a la mañana siguiente cuando se desea apareamiento. Recoger los embriones por el esfuerzo del agua usando un colador de malla fina de plástico.
- Gire el filtro al revés y enju....
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Resultados
Tratamiento Mtz para 36 hr (A36h, A significa ablación) 3,5 a 5 dpf reducido drásticamente el tamaño del hígado (Figura 1B). Después Mtz lavado, considerado como el comienzo de la regeneración del hígado (R), fuerte fabp10a: PPC-NTR y fabp10a: Expresión dsRed reapareció dentro de 30 horas (Figura 1B). La red biliar intrahepático, como se evaluó por la expresión de Alcam que está presente en la membrana de las BEC 22, colapsado inicialmente pero fue restablec.......
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Discusión
Severa, pero no leve, la ablación de hepatocitos provoca la regeneración hepática biliar impulsada. Por lo tanto, después del tratamiento Mtz y de lavado, es importante para examinar el tamaño del hígado de las larvas tratadas-Mtz, que puede ser evaluada por fluorescencia intrínseca de la PPC fabp10a: CFP-NTR transgén. Desde un pequeño porcentaje de las larvas tratadas-Mtz mostrará no separada por ablación (0-5%) o parcialmente ablación (10-20%) hígados, es esencial para ordenar y sólo analizar las larvas con u.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los Dres. Hukriede y Tsang por las discusiones. M.K. recibió el apoyo de una beca de capacitación de los NIH (T32EB001026). Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Fundación Americana del Hígado, la Fundación March of Dimes (5-FY12-39) y los NIH (DK101426) al D.S.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Polvo de éster etílico de ácido benzoico (tricaína) de 3 aminoácidos | Sigma-Aldrich | A5040 | Prepare un caldo de tricaína al 0,4% (15 mM): Lleve 0,4 g de tricaína a 100 ml con agua de huevo. Ajustar a pH 7. |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazol | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehído | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Sulfato de calcio dihidratado | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-feniltiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Medios de montaje (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm placa de Petri | Denville Científico Inc. | M5300 | |
| esmalte de uñas transparente | Fisher Scientific | 50949071 | |
| pinzas finas | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| portaobjetos de vidrio | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| cubreobjetos de vidrio | Fisher Scientific | 12-540-A y 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (ratón anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilución |
| cabra anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilución |
| rata anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilución |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-cabra IgG (H+L) | Laboratorios Jackson | 705-605-147 | dilución 1:500 |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Cabra Anti-ratón IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | Dilución 1:500 |
| Cy3 burro anti-rata IgG Laboratorios | Jackson | 712-165-150 | dilución 1:500 |
| microscopio de disección | Leica Microsystems | S6F | |
| microscopio de epifluorescencia | Leica Microsystems | M205FA | |
| microscopio confocal | Carl Zeiss | LSM700 | |
| agua | 0,3 g/L de sales marinas ' Océano instantáneo' y 0,5 mM de CaSO4 en agua destilada. | ||
| [header] | |||
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4· 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Llevar a 1 L con agua destilada. Ajuste el pH 7. Autoclave durante 20 min a 121°C. | ||
| 1X PBSDT, | 0.2% Triton X-100 y 0.2% DMSO en 1 X PBS. | ||
| Tampón | 30,2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Llevar a 1 L con agua destilada. Ajuste el pH 7. | ||
| Solución | Mezcle 1 ml de suero de caballo inactivado por calor con 9 ml de 1X PBSDT. |
Referencias
- Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. New concepts in liver regeneration. J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).
- Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 1....
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Reimpresiones y permisos
