Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

Summary

Describimos una técnica para medir simultáneamente la cinética de unión a un solo receptor regulado por fuerza e imágenes en tiempo real de la señalización de calcio en un solo linfocito T.

Abstract

Interacciones ligando-receptor de membrana median muchas funciones celulares. Cinética de unión y señalización corriente abajo provocada por estas interacciones moleculares son probablemente afectadas por el entorno mecánico en el que la unión y la señalización tienen lugar. Un estudio reciente demostró que la fuerza mecánica puede regular el reconocimiento del antígeno por y activación del receptor de células T (TCR). Esto fue posible gracias a una nueva tecnología que desarrollamos y fluorescencia denominado sonda de fuerza biomembrana (fBFP), que combina la espectroscopia de fuerza de una sola molécula con microscopía de fluorescencia. El uso de un glóbulo rojo humano ultra-suave como el sensor de fuerza sensible, una cámara de alta velocidad y en tiempo real técnicas de seguimiento de formación de imágenes, la fBFP es de ~ 1 pN (10 ^-12 N), ~ 3 nm y ~ 0,5 mseg en la fuerza, la resolución espacial y temporal. Con la fBFP, se puede medir con precisión la cinética individuales receptor-ligando vinculantes conforme al reglamento vigente y cal intracelular simultáneamente imagen desencadenó unión-CIUM señalización en una sola célula viva. Esta nueva tecnología puede ser utilizada para estudiar otras interacciones receptor-ligando de la membrana y de señalización en otras células bajo regulación mecánica.

Introduction

-Célula a célula y célula-matriz extracelular-a (ECM) adhesión está mediada por la unión entre receptores de la superficie celular, las proteínas ECM, y / o lípidos ^1. La unión permite que las células para formar estructuras funcionales ^1, así como reconocen, se comunican, y reaccionan con el medio ambiente ^3.1. A diferencia de las proteínas solubles (por ejemplo, citoquinas y factores de crecimiento) que se unen a partir de una de tres dimensiones (3D) fase de fluido sobre los receptores de la superficie celular, receptores de adhesión celular forman enlaces con sus ligandos través de un hueco de la unión estrecha para puent....

Protocol

Este protocolo sigue las directrices de y ha sido aprobado por el comité de ética de la investigación humana del Instituto de Tecnología de Georgia.

1. glóbulos rojos humano Aislamiento, biotinilación y la osmolaridad de Ajuste

Nota: Paso 1.1 debe ser realizado por un médico profesional entrenado como una enfermera, con una Junta de Revisión Institucional aprobado protocolo.

1. Obtener 8-10 l (una gota) de sangre de pinchazo en el dedo y añadir a 1 ml de la tampón carbonato / bicarbonato (Tabla 1 y 2). Vórtice suavemente o pipetear la mezcla y centrifugar durante 1 min....

Results

La técnica BFP fue iniciado por el laboratorio de Evans en 1995 ^17. Esta herramienta picoforce se ha utilizado ampliamente para medir las interacciones de proteínas inmovilizadas sobre superficies, a fin de analizar la cinética de dos dimensiones de las moléculas de adhesión interacción con sus ligandos ^{16,19,20, 30,} para medir la elasticidad molecular ^21,29, y para determinar conformacional proteína cambia ^21. Para una fBFP, un conjunto adicional de dispositivos relacionados .......

Discussion

Un experimento exitoso fBFP conlleva algunas consideraciones críticas. En primer lugar, para el cálculo de la fuerza para ser fiable, la micropipeta, el RBC, y el talón de la sonda deben estar alineados lo más cerca posible coaxial posible. La proyección de la RBC dentro de la pipeta debe ser alrededor de un diámetro pipeta sonda de manera que la fricción entre el RBC y la pipeta es insignificante. Para un típico RBC humano, el diámetro óptimo de la pipeta es 2,0-2,4 micras, que produce un mejor ajuste de la Ecuación 1 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fosfato de Sodio Monobásico Monohidrato (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Preparación de tampón de fosfato
Anhy. Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Preparación de tampón de fosfato
Carbonato de sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Preparación de tampón de carbonato/bicarbonato
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonato/bicarbonato Preparación tampón
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Preparación tampón N2-5%
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Preparación tampón N2-5%
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655	Preparación tampón N2-5%
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389	Preparación de tampón N2-5%
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Funcionalización de perlas
Biotin-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	Biotinilación de glóbulos rojos
Nistatina	Sigma-Aldrich	N6261	Ajuste de osmolaridad de glóbulos rojos
Hidróxido de amonio (NH4OH)	Sigma-Aldrich	A-6899	Perla de vidrio silanización
Metanol	BDH	67-56-1	Silanización de perlas
de vidrio Peróxido de hidrógeno al 30% (H2O2)	J. T. Barker	Jan-86	Silanización de perlas de vidrio
Ácido acético (glacial)	Sigma-Aldrich	ARK2183	Silanización de perlas de vidrio
3-Mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS)	Uct Specialties, llc	4420-74-0	Funcionalización de perlas de vidrio
Borosilicato Perlas de vidrio	Tecnología de partículas Distrilab	9002	Funcionalización de perlas de vidrio
Estreptavidina&menos; Maleimida	Sigma-Aldrich	S9415	Funcionalización de perlas de vidrio
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Funcionalizante de ligandos
Fura2-AM	Life Technologies	F-1201	Carga de colorante de fluorescencia de calcio intracelular
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Carga de colorante de fluorescencia de calcio intracelular
Perlas de PE Quantibrite	BD Biosciences	340495	Cuantificación de la densidad
Citómetro de flujo	BD Biosciences	BD LSR II	Cuantificación de la densidad
Tubo capilar 0.7-1.0 mm x 30 pulgadas	Kimble Chase	46485-1 Fabricación de	micropipetas
Flaming/Brown Micropipeta Puller Sutter		instrument P-97 Fabricación de	micropipetas
Microforce Narishige		MF-900	Fabricación de micropipetas
Aceite mineral	Fisher Scientific	BP2629-1	Montaje de cámara
Microscopio Cubierta de vidrio	Fisher Scientific	12-544-G Conjunto de	cámara
Microinyector	World Precision Instruments	MF34G-5 Montaje de	cámara
Jeringa de 1 ml	BD	Montaje	la cámara
Soporte para micropipetas	Narishige	HI-7 Montaje de	la cámara
Fabricación de piezas mecánicas y adaptadores de diseño propio mediante mecanizado CNC.	Instrumento de biofísica	Todas las piezas se personalizan de acuerdo con los diseños CAD.	Sistema BFP
Microscopio (TiE invertido)	MEA53100	BFP	Nikon
Objetivo CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)	MRH00401	BFP	Nikon
Cámara, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono	Graftek Imaging	02-2020C	Sistema BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", Montura C, 1280 x 960, Mono., CCD, ADC de 12 bits	Graftek Imaging	02-2185A	BFP sistema
Cabezal de sonda submicrónico manual con mando a distancia de alta resolución	Karl Suss	PH400	Sistema BFP
Mesa antivibratoria (5' x 3')	TMC	77049089	sistema BFP
etapa de traslación manual 3D	Newport	462-XYZ-M
SolidWorks 3D software CAD	SOLIDWORKS Corp.	Versión 2012 SP5	Sistema BFP
Software LabVIEW	National Instruments	Versión 2009	Sistema BFP, programa BFP
Etapa piezoeléctrica traslacional 3D	Physik Instrumente	M-105.3P	Sistema BFP
Accuador piezoeléctrico lineal	Physik Instrumente	P-753.1CD	Sistema BFP
Micromanager		Versión 1.4	Sistema fBFP, fluorescencia programa de imagen
Dual Cam (DC-2)	Fotometría		77054724 sistema fBFP
Filtro de emisión de doble leva (T565LPXR)	Fotometría		77054725 sistema fBFP
Cámara de fluorescencia	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600-10B	Sistema fBFP
Película de parafina plástica (Parafilm)	Bemis Company, Inc	Sellado de botellas PM996
Carbonato/ tampón de bicarbonato (pH 8,5)			8,4 g/L de carbonato de sodio (Na2CO3), 10,6 g/L bicarbonato de sodio (NaHCO3)
Tampón de fosfato (pH 6,5-6,8)			27,6 g/L NaFosfato monobásico (NaH2PO4 y toro; H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfato dibásico (Na2HPO4)
Tampón N2-5% (pH 7,2)			20,77 g/L cloruro de potasio (KCl), 2,38 g/L cloruro de sodio (NaCl), 0,13 g/L fosfato de potasio monobásico (KH2PO4), 0,71 g/L de anhy. fosfato sódico dibásico (Na2HPO4), 9,70 g/L de sacarosa