Realización Permanente distal cerebral media carótida común con oclusión de la arteria en ratas de edad avanzada para el Estudio de la isquemia cortical con sostenida de la discapacidad

Summary

Aquí se presenta un protocolo para producir una oclusión distal medio permanente de la arteria cerebral en ratas hembras de edad avanzada con la oclusión simultánea de las arterias carótidas para generar grandes infartos corticales y los déficits sostenidos. Mostramos la confirmación del tamaño de la lesión mediante resonancia magnética estructural a las 24 horas y 8 semanas después del accidente cerebrovascular.

Abstract

Stroke típicamente ocurre en las personas de edad avanzada con una gama de comorbilidades incluyendo carótida (u otro arterial) la aterosclerosis, la hipertensión, la obesidad y la diabetes. En consecuencia, cuando la evaluación de terapias para el accidente cerebrovascular en animales, es importante seleccionar un modelo con excelente validez cara. El derrame cerebral isquémico el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares, y la mayoría de éstos se producen en el territorio de la arteria cerebral media (ACM), a menudo inducir infartos que afectan a la corteza sensoriomotora, causando plejia persistente o paresia en el lado contralateral del cuerpo. Nosotros demostramos en este vídeo un método para producir el accidente cerebrovascular isquémico en ratas de edad avanzada, lo que provoca la discapacidad sensoriomotora sostenido y infartos corticales sustanciales. Específicamente, inducimos oclusión permanente distal la arteria cerebral media (MCAO) en ratas hembras de edad avanzada mediante el uso de pinzas de diatermia para ocluir un segmento corto de esta arteria. La arteria carótida en el lado ipsilateral a la lesión era entonces permanently ocluido y la arteria carótida contralateral fue ocluida transitoriamente durante 60 min. Medimos el tamaño del infarto mediante imágenes de resonancia magnética ponderadas en T2 estructural (MRI) a las 24 horas y 8 semanas después del accidente cerebrovascular. En este estudio, el volumen de infarto media fue de 4,5% ± 2,0% (desviación estándar) del hemisferio ipsilateral en 24 hr (corregido para la inflamación del cerebro usando la ecuación de Gerriet, n = 5). Este modelo es factible y clínicamente relevante ya que permite la inducción de déficit sensoriomotoras sostenidos, que es importante para la elucidación de los mecanismos fisiopatológicos y nuevos tratamientos.

Introduction

El accidente cerebrovascular es actualmente la tercera causa más común de muerte en el mundo y la principal causa de discapacidad ^1. El accidente cerebrovascular isquémico, que comprende el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares, a menudo resulta en infartos en la corteza causando la pérdida de la sensibilidad (por ejemplo, la propiocepción), en la función motora y en atención a la parte afectada ^2-4. La arteria cerebral media (ACM) es el más grande de los vasos que atrae a la oferta del círculo de Willis y se deriva de la arteria carótida interna ^5. El MCA es el vaso cerebral más comúnmente afectados en el accidente cerebrovascular isquémico, con trazos en este territorio que representa el 65% de todos los ictus isquémicos ^6,7. La CRM suministra ambas regiones corticales y subcorticales y anormalidades neurológicas causadas por un accidente cerebrovascular MCA varían dependiendo de la ubicación exacta de la oclusión ^7. oclusiones proximales MCA afectan el territorio profunda a través de las arterias lenticulostriatal y causan infartos grandes que abarcan tanto cortical y regiones subcorticales. Por el contrario, las oclusiones más distales que privan a las regiones corticales exclusivamente del flujo de sangre tienden a producir infartos corticales más pequeños.

En grandes estudios de población, las lesiones de accidente cerebrovascular humanos van desde 5-14 de% del hemisferio ipsilateral ^8,9; El derrame cerebral maligno para el 10% de los accidentes cerebrovasculares y da lugar a infartos más grandes, lo que requiere un hemicraniectomía para reducir la presión intracraneal, y los pacientes con lesiones más pequeñas tienen más probabilidades de sobrevivir ^10. Demostramos un modelo reproducible, que produce lesiones que ocupan una proporción similar del hemisferio tantos trazos humanos.

El accidente cerebrovascular es una enfermedad heterogénea; 75% de los ictus isquémicos son inducidos por cualquiera de infartos lacunares (de obstrucción de los vasos intracraneales pequeñas); ictus cardioembólico; o aterosclerosis de las arterias grandes, lo que representa el 30% de los accidentes cerebrovasculares. aterosclerosis sintomática se observa con mayor frecuencia en el punto en el c comúnarteria arotid (CCA) se ramifica en las arterias carótidas internas y externas ^11.

modelos preclínicos de accidente cerebrovascular deben ser lo más similar a la condición humana como sea posible para simular su fisiopatología y debe incorporar los factores de riesgo de accidente cerebrovascular. 92% de accidente cerebrovascular isquémico ocurre en personas mayores de 65 años, y otros factores de riesgo incluyen la obesidad, la hipertensión y la aterosclerosis, como se indicó anteriormente ^12. Para representar mejor a estos factores de riesgo, se recomienda utilizar un modelo que pueden compartir algunas de las características fisiopatológicas de la condición natural. En este protocolo, se ha incluido la edad avanzada y el flujo sanguíneo obstruido a través de las arterias carótidas.

El modelo clásico de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) es el modelo de filamento intraluminal de MCA oclusión proximal, lo que reduce el flujo sanguíneo en la parte anterior y arterias cerebrales medias. tiempos de oclusión cortas usando este modelo se centra la lEsion a la región subcortical, mientras que los tiempos de oclusión más largas pueden dar lugar a lesiones grandes áreas de ambas las áreas corticales y subcorticales, lo que resulta en una tasa de mortalidad más alta en las ratas de edad avanzada de reclutamiento. En comparación, el modelo utilizado por nuestro grupo implica la realización de una craneotomía y la apertura de la duramadre seguido de la coagulación de la sangre y la destrucción de una pequeña porción de la MCA con unas pinzas de cauterización bipolares. Este modelo de diatermia es una adaptación del artículo de 1981 por Tamura et al. ²³ y el uso de la craniectomía puede limitar aumento de la presión intracraneal, que es una característica del cráneo cerrado, y resulta en una mayor reproducibilidad y una tasa de mortalidad más baja en nuestra cohorte cirugía en comparación con algunos otros modelos ^13. Para generar infartos reproducibles y sostenida de la discapacidad que ocluyen de forma permanente los extremos proximal CCA y transitoriamente ocluir el CCA distal según Chen imágenes de resonancia magnética ponderadas en T2 no invasiva y col. ¹⁴ Utilizamos nuclear (RMN) Para evaluar la extensión y localización del infarto cerebral, y el grado de hinchazón del cerebro en el córtex sensoriomotor.

Protocol

Este protocolo fue aprobado por las normas institucionales establecidas por el Kings College de Londres, y se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Ministerio del Interior del Reino Unido y Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley de 1986. Las directrices puede variar entre las instituciones; por favor asegúrese de adhesión a las directrices institucionales antes de intentar este procedimiento. Con el fin de mantener una técnica aséptica al tocar el equipo, el autoclave un gran trozo de papel de aluminio y usar esto para envolver alrededor de equipo maneja como en la máquina microscopio y la anestesia. film transparente estéril (cubierta plástica) también puede ser utilizado.

1. Preparación

1. Familiarícese ratas con paquetes de fluido gel (gel de recuperación veterinaria) y Chow suave durante al menos 48 horas antes de la cirugía del accidente cerebrovascular. Como los animales a menudo se encuentran la dificultad para comer y beber después del procedimiento, la introducción de los animales a estos elementos antes de la cirugía, para reducir al mínimo la neofobia. ratas de edad avanzada con las casas de madera para masticar bloCKS para reducir la incidencia de los dientes demasiado grandes (véase la sección 6).
2. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos antes de comenzar los procedimientos quirúrgicos en autoclave (mínimo 121 ° C, 15 PSI, para 15 min). Desinfectar todas las superficies de trabajo utilizando 1% de clorhexidina en 70% de etanol y el uso de paños quirúrgicos y mantener una técnica aséptica durante la duración del procedimiento.
3. Inducir lesiones en el hemisferio contralateral a la pata preferido. Asignar lesiones a la izquierda o el hemisferio derecho en función de sus patas delanteras preferida de cada rata, determinado por las líneas de base antes de la operación en el ensayo de la escalera Montoya ^{15 (véase} la Figura 4). Por simplicidad, cuando se describe este procedimiento en este manuscrito, la pata izquierda es la pata preferida, y las cirugías se realizan en el hemisferio derecho. Utilice Lister Hooded o ratas Long Evans para estas pruebas de comportamiento a medida que aprenden rápidamente.
   Nota: El ensayo de la escalera está diseñado para medir los cambios en ambos fina y gruesa m expertoovements siguientes daños en el sistema motor. La escalera consta de siete pasos en cada lado de una plataforma central. Si el equipo para el ensayo de la escalera no está disponible, la prueba del cilindro es una alternativa adecuada para uso de las manos las pruebas, pero tenga en cuenta que sólo hay un déficit transitorio en esta prueba en este modelo de accidente cerebrovascular, y por lo tanto no será adecuado para medir la recuperación a largo plazo después de tratamiento.
   1. Coloque tres bolitas de azúcar en el pozo de cada paso (21 Bolitas por lado). Coloque las ratas en el aparato de la escalera durante 10 minutos y registrar el número de perdigones recuperados y el número de gránulos de desplazados en cada lado.
      Nota: Para ser incluido en la tarea después de la cirugía, las ratas deben recuperar un mínimo de 75% bolitas al inicio del estudio.

2. Cirugía

1. Utilice ancianos ratas Lister Hooded-hembra, con 16-18 meses (250 a 400 g) y inducir la anestesia con isoflurano 5% en 1,5 L / min de O _2. Después de la inducción de la anestesia, reducirel nivel de isoflurano y mantenerla a una profundidad adecuada, pero reducido al mínimo para la cirugía (por ejemplo, 1,5-2%). Entregar la anestesia al animal mediante una mascarilla, y utilizar un sistema de depuración para limitar la exposición del cirujano para isoflurano.
   1. Realizar todos los procedimientos hasta, pero no incluyendo craneotomía en animales de simulación, ya que este procedimiento puede producir anomalías de comportamiento ^16. Considere los objetivos experimentales en el diseño de experimentos MCAO, y decidir si es o no un grupo de simulación para el control de la craneotomía debe ser incluido.
2. Administrar el alivio del dolor pre- o peri-operativa (Carprieve, 0,25 mg / kg, s. Corte).
   1. Añadir 1 ml a 19 ml estéril 0,9% de solución salina para hacer la solución madre y se inyectan 0,6 ml por 300 g de rata. El uso de Carprieve se prefiere sobre carprofeno porque el primero es estable a RT.
3. Afeitar la piel en la región ventral del cuello y la región temporal del hemisferio derecho para exponer la piel. Desinfectar los sitios quirúrgicos ucantar hisopos de etanol. Asegúrese de seguir las directrices locales IACUC para la depilación.
   1. Realice este paso de la zona de operación para minimizar la cantidad de piel en el sitio de la incisión.
4. Coloque la rata en un panel de corcho cubierta con un paño estéril en la posición supina sobre una almohadilla térmica. Aplicar crema de lidocaína a las regiones afeitado de la cabeza y el cuello. Inserte una sonda rectal para controlar y mantener la temperatura del animal entre 36,5 a 37,5 ° C con un sistema de homeotermos.
   1. Ponga pomada Lacrilube en los ojos para evitar que se seque. Dar la rata una inyección de solución de sulfato de atropina (0,05 ml de una solución de 600 mg / ml, por vía subcutánea) para reducir las secreciones traqueales.
      Nota: Los investigadores deben considerar la medición de variables fisiológicas, tales como los gases en sangre y la presión.
5. Antes de comenzar la cirugía, comprobar la retirada de la pata trasera pellizco y reflejo de parpadeo para confirmar anestesia total.
6. Bajo un micro disecciónámbito de aplicación, hacer una incisión de 2 cm de la línea media central sobre el cuello expuesto utilizando un bisturí. Mover las glándulas salivales suavemente laterales a la tráquea en ambos lados.
7. Lazo de sutura de seda no absorbible alrededor de la piel que cubre la arteria carótida común en un lado. tire suavemente la piel del sitio utilizando la sutura de seda y se adhieren a estas abajo del panel de corcho utilizando cinta quirúrgica para revelar la arteria carótida común. Blunt cuidadosamente diseccionar las arterias libres de la fascia que rodea los nervios vagos y utilizando unas pinzas finas.
   1. Tenga cuidado de no dañar el músculo o nervio vago durante este paso, ya que esto perjudicará la alimentación, la deglución y la respiración.
8. Una vez que la arteria carótida común se expone, utilizar sutura de seda no absorbible (5/0) para aislar la carótida, en primer lugar la separación de la carótida del nervio vago por la inversa de disección con unas pinzas finas y con cuidado de no hacer contacto con el nervio. Una vez que el buque ha sido bucle (pero no atado) con la sutura, timitar a los extremos de la sutura en conjunto con cinta quirúrgica para evitar este paso de ser deshecho. Retire las suturas que frenan la piel que lo recubre.
9. Repita para el otro lado (Secciones 2.7-2.8)
10. Colocar una gasa empapada en solución salina estéril en la herida para mantener tejidos húmedos durante el resto de la cirugía. Sin apretar suturar la piel y colocar una gasa empapada en solución salina adicional sobre el área para prevenir una mayor deshidratación.
11. Coloque ratas en una posición lateral y hacer una incisión en la piel en el punto medio entre la órbita derecha y el conducto auditivo externo. Retraer la piel utilizando hasta cinco retractores de gancho 3 mm elásticas fijadas a la panel de corcho y luego blunt diseccionar el músculo temporal para revelar el cráneo.
12. Coloque el pulgar rueda ajustados en función de la gravedad impulsada por goteo de solución salina por encima del lugar abierto (velocidad de flujo de aproximadamente 2 ml / min) y establecer un sistema de aspiración para eliminar los residuos de hueso y para borrar sangrado menor de sitio expuesto a lo largo de esta fase de la cirugía ( Sectaiones 2.13-2.16).
    1. Coloque la boquilla de suministro de solución salina en el punto más alto del cráneo cerca de la oreja, y la boquilla de aspiración en el punto más bajo. Ajustar la rueda durante hemorragias para suministrar más de solución salina a la zona para visualizar mejor la fuente de cualquier purga para la cauterización de la embarcación, lo que reduce la cantidad de tiempo que los animales están bajo anestesia.

Figura 1. conjunto quirúrgico de modelo cerebral media distal permanente oclusión de la arteria. El equipo utilizado en la puesta a punto para la craneotomía rata se muestra para el hemisferio derecho, y la inserción, el posicionamiento del aspirador y solución salina por goteo alrededor del sitio de la craniectomía. También se muestran las características clave de la vasculatura; la arteria cerebral media (roja) y la vena cerebral inferior (azul) se muestran, y el área sombreada indica el lugar donde se produce la coagulación de la arteria.La confirmación de la oclusión se lleva a cabo mediante la reducción de la MCA por debajo de la vena cerebral inferior. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

13. Realizar una craneotomía en la región expuesta (aproximadamente 5 mm x 5 mm) usando un taladro dental con un grueso de 1,6 mm con recubrimiento de diamante de perforación rebabas aproximadamente a 8.000 rpm, lo que garantiza la aplicación de la circular y la presión lateral y la presión no hacia abajo, mientras que la perforación de la zona expuesta . Una vez que el hueso es lo suficientemente delgada que se ve completamente transparente, eliminar el uso de fórceps.
14. Utilice un gancho dural casera, hecha doblando una punta de unas pinzas finas de aproximadamente 180 ° para formar un arco, para abrir cuidadosamente la dura, teniendo cuidado de evitar los grandes vasos sanguíneos de la superficie, ya que son delicados y fácil de romperse.
    Nota: El área expuesta del cerebro revelará la arteria cerebral media (MCA); el segmento deseadomedidas de aproximadamente 2 mm de longitud (véase la Figura 1, recuadro).
15. Coagular el MCA desde donde la vena cerebral inferior atraviesa, hasta el punto de bifurcación de la arteria y luego a lo largo de las ramas caudales de la CRM utilizando un par de pinzas de diatermia hasta que esté totalmente ocluida ^17. El uso de fórceps joyero de diatermia en ángulo con 0,25 mm puntas.
    1. Cuando la oclusión de la arteria, alterar el flujo según sea necesario la solución salina para mantener esta área fresca, evitando que los fórceps de coagulación se adhiera al vaso sanguíneo. Cuando ocluido, el vaso sanguíneo aparece negro y ninguna señal de flujo de sangre debe estar presente; el flujo de sangre puede ser visto en los vasos parcialmente ocluidos.
    2. Cortar la MCA en este momento para confirmar la oclusión completa. Con unas tijeras microvasculares, cortados por debajo de donde la vena cerebral inferior cruza la MCA.
    3. Cubrir el área expuesta con una gasa empapada en solución salina antes de continuar con el siguiente paso.
16. Girar la rata de nuevo a una posición supinación y volver a abrir la sutura sin apretar atada en el cuello para volver a exponer las arterias carótidas. Ligar la arteria carótida en el mismo lado que el MCA ocluida (derecha) de forma permanente por un nudo en la sutura de seda alrededor de la carótida, mientras que la arteria carótida izquierda se ocluye transitoriamente utilizando un clip de la arteria de acero inoxidable 13 mm con 125 g de presión para 60 min. Sin apretar la sutura de la incisión en el cuello durante este tiempo y colocar una gasa estéril empapada de solución salina en la parte superior para evitar la deshidratación.

1. Tenga en cuenta que parte derecha del animal estará en el lado izquierdo del cirujano, dada la posición en decúbito supino.
2. Para los animales sham, abrir la parte ventral del cuello y las regiones temporales y separar los músculos para localizar las arterias carótidas comunes, pero no ocluir. Han simulacro de animales sometidos a procedimientos hasta, pero no incluyendo craneotomía, ya que este procedimiento puede producir anomalías de comportamiento ^16. Para mantener el cegamiento de la otra tEAM miembros (por ejemplo, durante las pruebas de comportamiento más adelante), realizan incisiones y suturas.

Figura 2. Tandem carótida oclusión después de la oclusión de la arteria cerebral media. La arteria carótida común derecha (CCA) se ocluye de forma permanente atando una sutura de seda (5/0) alrededor del vaso sanguíneo (en el lado izquierdo de la imagen). El CCA la izquierda (en el lado derecho) está ocluida por 1 hr con una abrazadera de microvascular. Estas cirugías se llevaron a cabo con cuidado de no hacer contacto con el nervio vago en cada lado (blanco). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

17. Suturar la incisión en la región temporal durante la 1 h de oclusión de la carótida común izquierda.
18. Dar a ratas por vía subcutánea 20 ml de solución salina (5 ml a dos sitios en cada flanco) para mantener la hidratación (véase6.2).
19. Cuando ha pasado 60 minutos, retire el clip. Aplicar la solución salina por vía tópica al músculo circundante, y cerrar la incisión en el cuello con la costura continua subcutánea de suturas absorbibles (4/0).

3. Cuidados después Operativo

1. Coloque la rata en una incubadora a 31 ° para recuperarse de la anestesia para un máximo de 4 hr.
   Nota: Los investigadores puede preferir utilizar otras temperaturas y duraciones de acuerdo con la práctica local.
2. carprieve Repeat (0,25 mg / kg), para el alivio del dolor a las 24 horas. Debido a que todos los animales reciben la misma dosis de Carprieve, este factor se controla para sistemáticamente. Cualquier efecto neuroprotector de Carprieve es probable que sea insignificante.
3. Dar inyecciones de solución salina al día para prevenir la deshidratación durante al menos los primeros tres días. En el supuesto de que una rata requiere 65 ml de líquido por kg de peso corporal (cada 24 horas), asegúrese de que cada 300 g de rata recibe ~ 22 ml fluidos por día.

4. Conconfirmación de un infarto

1. Para medir el volumen de infarto utilizar MRI estructural.
   Nota: Un método alternativo podría ser el uso de la tinción histológica, tal como cloruro de tetrazolio (TTC), que se ha correlacionado previamente a los datos de MRI estructurales ^18. Sin embargo, esto sólo se puede utilizar en el punto final del estudio, y no en sentido longitudinal.
   1. Veinticuatro horas después de la inducción de la MCAO, anestesiar las ratas con isoflurano (5% para la inducción, 1-1,5% para mantenimiento) en 0,9 L / min de aire médico y 1 L / min O _2, seguro en una bobina de resonancia magnética cuadratura birdcage (43 mm de diámetro) y colocar en un escáner de perforación horizontal 7 Tesla.
   2. Obtener exploraciones T2 ponderadas utilizando una secuencia de eco de spin rápido: tiempo de eco (TE) de 60 ms, tiempo de repetición (TR) 4,000 ms, campo de visión (FOV) de 40 x 40 mm, matriz de adquisición 128 x 128, la adquisición de 40 x 0,5 mm rodajas gruesas de aproximadamente 8 minutos. Posteriormente, convertir 40 rebanadas en rodajas gruesas 20 x 1 mm utilizando el RESAMPLing función en el software de tratamiento de imágenes médicas.
2. Obtener volúmenes de lesión en un paquete de visualización de la imagen médica midiendo el área en sección transversal de infarto en 20 volúmenes. Obtener el volumen total multiplicando la suma de estas áreas por el espesor (1 mm). Calcular la media de grupo de volumen y la desviación estándar. Para los cálculos de volumen de la lesión porcentuales, también adquirir los volúmenes de los hemisferios ipsilesional y contralesional.
3. Para corregir para la inflamación cerebral debido a un edema, ajustar estos valores mediante fórmulas GERRIETS ^'18. Sólo incluir secciones que contienen la corteza y que no contienen el cerebelo o bulbos olfatorios según un atlas estándar para ratas ¹⁹ para evitar el exceso de corrección, ya que esto puede generar volúmenes de lesión negativos.
   1. Adquirir imágenes ponderadas en T2 nuevo 8 semanas después de la cirugía del accidente cerebrovascular.

5. Los cálculos de tamaño de muestra para estudios futuros que evalúen la neuroprotección y de Comportamiento recuperación

1. Realizar los cálculos del tamaño de muestra para estimar el tamaño mínimo de la muestra que se requeriría en futuros experimentos neuroprotectores hipotéticos utilizando dos grupos (control vs. Tratamiento) para identificar los efectos del tratamiento de tres magnitudes diferentes (reducción del 25%, la reducción de un 50%, reducción del 75%) usando las priori algoritmos implementados en un software de análisis ^de potencia 20.
   Nota: Para que los lectores puedan hacer cálculos similares con sus propios datos, hay capturas de pantalla de software de análisis de poder de libre disposición (ver resultados representativos). Utilice los siguientes parámetros: tasa de falsos positivos aceptables (es decir, el umbral de error de tipo I; α) ≤0.05, y el poder (que es igual a 1-β) ≥0.80 (es decir, superior al 80% de potencia). Véase más abajo para una discusión explicaciones y ^21.

6. Derechos de los animales después de la cirugía de carrera de ancianos

1. Poner a disposición adicional suave Chow unand gel de rehidratación paquetes que las ratas se habituaron a antes de la cirugía, además de las botellas de agua con extremidades extendidas para el más fácil alcance. Además, tienen una almohadilla de recuperación absorbible en las jaulas en lugar de ropa de cama suelta (es decir, evitar astillas de madera) durante las primeras 24 horas, y obtener una capa de anidación adicional. No utilice los alimentos en puré (por ejemplo, alimentos para bebés) como las ratas con disfagia pueden ahogarse.
2. Pesar los animales al día durante 7 días para monitorizar la recuperación. La pérdida de peso es una indicación primaria de la deshidratación y el estrés. La pérdida de peso en los primeros días después de la cirugía refleja principalmente la deshidratación (en lugar de la pérdida de peso corporal debido a la reducción en la alimentación).
3. Cuando una rata de envejecimiento muestra la pérdida de peso no relacionados con la cirugía, reemplazar el peso corporal perdido con un peso equivalente de fluidos e inspeccionar los dientes superiores e inferiores. Donde los dientes se hacen salvajes, anestesiar la rata con isoflurano (como en la sección 2.1), y colocar en una posición supina
   1. Coloque un cilindro de jeringa de 1 ml por detrás del teeth para proteger los tejidos blandos. Cortar con una sierra circular de mano (por ejemplo, de aproximadamente 3 cm de diámetro) a alta velocidad de rotación, pero con movimientos de las manos firmes lentos (por ejemplo, 3 cortes seg). Permitir que los dientes de las ratas se enfríen entre los cortes. Asegúrese de que la sierra rotativa está montado en el mandril de manera que los dientes de la sierra se enfrentan en la dirección de rotación. Vale la pena tener sierras giratorias envueltas individualmente, esterilizado listo para tales eventualidades.
      Nota: El crecimiento excesivo puede ocurrir en ratas de edad avanzada, incluso cuando se mantienen en una dieta de pellets duro. Recomendamos que los dientes se comprueban en ratas de edad avanzada con regularidad.
4. Cuando una rata de edad avanzada muestra la pérdida de peso y piloerección no relacionado con cirugía, las opciones de tratamiento con un veterinario. Considere la posibilidad de matar al animal con humanidad. RM de estos animales puede mostrar un tumor hipofisario (a menudo en las ratas hembras de edad avanzada) que es inoperable y fatal.

Results

MCAO permanente fue inducida por la craneotomía realizar, seguido de la coagulación y la destrucción de la arteria cerebral media por diatermia combinado con oclusión permanente de la arteria carótida común ipsilesional y 60 min la oclusión de la arteria carótida común contralesional. Un diagrama esquemático de la configuración de los equipos y ocluido MCA se muestra en la Figura 1, y de las arterias carótidas en la Figura 2 (arriba).

pronóstico del accidente cerebrovascular se evaluó 24 horas y 8 semanas después del accidente cerebrovascular mediante la medición del volumen del infarto en 40 x 0,5 mm rebanadas (desde el extremo rostral del bulbo olfativo a extremo rostral de la médula espinal) usando la Región de kit de herramientas de interés en un paquete de visualización de la imagen médica. Una resonancia magnética estructural T2 ponderada representativa se muestra para el mismo animal a las 24 horas y las 8 semanas (Figura 3A). El volumen del infarto fue identificado por las áreas del cerebro de rata que muestra una señal hiperintensa; como el peso T2ed imágenes muestran el agua o el plasma como un área de color blanco brillante. Se sabe que hay un aumento en el edema y la inflamación del cerebro después del accidente cerebrovascular, y esto se puede medir de una exploración en T2 que se ha correlacionado con las mediciones histológicas de volumen del infarto ^18. Sin embargo, el edema presente temprana después del accidente cerebrovascular (por ejemplo, a las 24 horas) puede conducir a una sobreestimación del volumen de la lesión final (por ejemplo, a las 8 semanas) y por lo tanto también presentes los volúmenes de infarto media ajustada usando las fórmulas de Gerriet. Figura 3B muestra datos de la media de el (sin ajustar) volumen de la lesión en bruto a las 24 horas como 62,8 mm ³ (± 25,4 ^mm3 SD, gráfico superior); Este ocupa el 9,8% del hemisferio afectado (± 4,2% SD, gráfico central). Cuando se corrige para la inflamación cerebral mediante fórmulas 'GERRIETS este valor se redujo a 4,5% (± 2,0% SD, gráfico inferior).

Gravedad del accidente cerebrovascular también se midió usando el ensayo de la escalera Montoya ^15. En resumen, unanimals fueron pre-entrenados para recuperar gránulos de azúcar durante 4 semanas antes de la cirugía MCAO derrame cerebral, y la prueba de 8 semanas después del accidente cerebrovascular (Figura 4) para confirmar un déficit sostenido. Las ratas se colocaron en el aparato de escalera para 10 min y se registró el número de gránulos recuperado (de 21 gránulos) y se muestran como un porcentaje (grupo significa ± error estándar). Se realizó un análisis de regresión para adaptarse a la línea a los datos.

La figura 5 muestra el cálculo del tamaño de muestra usando datos de volumen de infarto (para los efectos potenciales de las terapias candidatos), analizó utilizando un algoritmo en el software de análisis de potencia para un t-test utilizando "Diferencia entre dos medios independientes (dos grupos)" y el uso de la (sin corregir ) medias y desviaciones estándar de la figura 3B. La información en la Figura 5 y la Tabla 1 muestran que 12 ratas se requeriría por grupo para detectar una terapia que reduce infCRAT volumen en un 50% a las 24 horas, mientras que la figura 6 muestra un "diagrama XY" del poder conseguido utilizando un número variable de animales. La Tabla 1 resume los cálculos del tamaño de la muestra para todos los puntos temporales.

Figura 3. resonancia magnética estructural en T2 se utiliza para medir el tamaño del infarto y el edema cerebral tras un accidente cerebrovascular. (A) Una imagen de resonancia magnética ponderada en T2 de la misma rata cerebro de 24 horas y 8 semanas después de la inducción de accidente cerebrovascular. El área blanca representa la lesión, pero también contiene algo de edema vasogénico que resuelve por 8 semanas. Volúmenes (B) de infarto se midieron utilizando un paquete de visualización de imágenes médicas Región de Interés Toolkit y se trazan en un gráfico que representa la media ± desviación estándar para los 3 puntos de tiempo utilizados (n = 6). volumen de la lesión en bruto (no corregida para la inflamación cerebral debido a edema), porcentaje de lesión del hemisferio afectados (sin corregir la hinchazón), y el porcentaje de lesión del hemisferio corregido para la inflamación cerebral utilizando fórmulas GERRIETS 'se muestran aquí. SD fue utilizado en lugar de SEM con el fin de realizar los cálculos del tamaño de la muestra (véase la Figura 5). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. El ensayo de la escalera muestra deficiencias en el agarre y la recuperación de gránulos. En este modelo accidente cerebrovascular había muy poca recuperación espontánea. Derrame cerebral en ratas de edad avanzada afecta persistentemente destreza, mostrado por las pruebas semanales utilizando el "ensayo de la escalera" de pellets de llegar. Recuadro: Una imagen de una rata de realizar la prueba de comportamiento. El gráfico muestra la media (± soportenúmero ard error) de los gránulos recuperados (de 21, expresado como porcentaje) por semana por la pata afectada. n = 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. cálculos Tamaño de la muestra para determinar el número de grupos de ratas requeridas para detectar un efecto terapéutico deseado. Esta captura de pantalla, tomada de software de análisis de potencia, muestra que 12 ratas por grupo serían necesarios para detectar una terapia que reduce el volumen de infarto en un 50% a las 24 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

/> Figura 6. Poder consigue utilizando diferentes números totales de los animales. Un "gráfico XY para un rango de valores" de software de análisis de potencia muestra el poder que se obtendría, para experimentos con diferentes números (total) de las ratas de edad avanzada, teniendo en cuenta los parámetros se muestra en la Figura 5. Tabla 1 resume todos los resultados. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tiempo después del accidente cerebrovascular:	Número de ratas por grupo requerido para detectar una reducción en el volumen de la lesión de:
	75%	50%	25%
24 hr	6	12	42
8 semanas	4	5	17

Tabla 1. Los cálculos de los tamaños de las muestras por grupo para hipotéticos futuros experimentos. Calculado usando el software de análisis de potencia (Ver Figuras 5 y 6). Tabla muestra el número de ratas por grupo requerido para un experimento de dos grupo para detectar un 25%, 50% y 75% de reducción en volumen de la lesión en cada uno de los puntos de tiempo en este estudio.

Discussion

MCAO en roedores es una técnica frecuentemente utilizada para modelar apoplejía humana. Este modelo tiene algunos detalles a tener en cuenta en el protocolo. En primer lugar, es esencial para mantener la temperatura del cuerpo del animal durante todo el experimento ya que esto afecta el tamaño del infarto y el número de muertes en un estudio. Puede ser posible interrumpir isoflurano durante la oclusión transitoria de la CCA derecha y seguir las ratas en un ambiente calentado, tranquilo para aumentar las tasas de supervivencia al reducir la exposición a isoflurano. Los investigadores deben considerar si un período más corto de anestesia es mayor que la tensión de inducción adicional. La vasculatura (por ejemplo, MCA ramificación) de las ratas varía dentro y entre cohortes de animales ^22. Es importante tener esto en cuenta al comenzar un nuevo estudio. Diferentes tiempos de oclusión CCA se pueden evaluar (por ejemplo, 30, 45, 60 y 90 min). En este estudio se utiliza un tiempo de oclusión de 60 min. En otros estudios se ha encontrado que 45min oclusiones causan un infarto cortical de tamaño similar, pero con la evidencia anecdótica de mejores tasas de supervivencia. En consecuencia, tienen los cirujanos comienzan con un corto tiempo de oclusión (por ejemplo, 30 minutos) para ver si se obtienen volúmenes de lesión adecuados (y / o anomalías de comportamiento requeridas) y sólo después de aumentar los tiempos de oclusión en caso necesario. déficits conductuales no se sostienen en ratas adultas en comparación con las ratas de edad avanzada con tiempos de oclusión idénticos.

La RM se puede utilizar para juzgar si (después de un tiempo de oclusión en particular) volúmenes de lesión son apropiadas para los objetivos del estudio. Una lesión pequeña abarcaría menos del diez por 0,5 mm cortes coronales (de los 40). Una lesión de tamaño medio se extendería entre diez y veinte cortes coronales. Una lesión grande se extendería entre veinte y treinta cortes coronales. Una lesión muy grande se extendería más de treinta de los cuarenta rodajas. En nuestra experiencia, las ratas con lesiones muy grandes (más de treinta rebanadas) y / o evidencia de hernia Across de la línea media por lo general tienen un mal pronóstico: los tiempos de oclusión más cortos podrían ser considerados. La RM también es útil para evaluar la localización del infarto: algunos son más caudalmente localizados y algunos se encuentran más rostral.

Tenga mucho cuidado al separar el nervio vago de ambas arterias carótidas comunes. Rales (raspado) se puede producir después de la cirugía accidente cerebrovascular y esto podría ser debido al daño nervioso en algunos animales, aunque la causa es claro en la actualidad: en nuestra experiencia, el pronóstico es muy pobre para estos animales y por lo general se recomienda para matar humanitariamente ellos.

Las permanentes diatermia MCAO resultados del modelo en infartos corticales reproducibles y las tasas de supervivencia después de la operación aceptables en ratas de edad avanzada. La técnica, sin embargo, requiere cirugía invasiva bajo un estereomicroscopio. Es importante mantener una técnica aséptica si los animales han de recuperarse bien de la cirugía. Se debe tener cuidado de no dañar la MCA mientras que la exposición y coagular la arteria,y daño a la superficie cortical debe reducirse al mínimo de lo contrario el área expuesta de la corteza pueden formar parte de la zona del infarto. Se recomienda obtener tanta experiencia como sea posible para establecer el procedimiento y lograr infartos consistentes y determinar los tiempos de oclusión antes de que un estudio se realizó para probar terapias candidatos, por ejemplo. El experimentador debe cambiar aleatoriamente los tratamientos dentro de las sesiones de cirugía ( "bloque de la aleatorización") siempre que sea posible. Vale la pena señalar que este modelo no involucra MCA reperfusión (a menos transitoria ligadura de MCA se utiliza en lugar de diatermia). La mortalidad puede ser alta en ratas de edad avanzada con estas grandes infartos corticales, pero debe ser posible para reducir la mortalidad mediante el uso de tiempos de oclusión más cortos y minimizando la exposición a la anestesia general cuando sea posible (por ejemplo, durante la oclusión). El uso de 70% de N _{2 O y 30%} de O2 como un vehículo que puede permitir que los niveles más bajos de isoflurano a utilizar: esta exposición reducida a isofluRane puede dar lugar a mayores tasas de supervivencia.

Otro punto a considerar es que la aterosclerosis es un proceso gradual, mientras que en este protocolo se simula con la oclusión aguda de la CCA. Sin embargo, la reducción sustancial en el flujo sanguíneo y los déficits sostenidos simular oclusiones en tándem que se producen en muchos pacientes con accidente cerebrovascular. Permanente distal MCAO sin tándem CCA oclusión en ratas no induce trazos reproducible ^14: además, sin tándem CCA oclusión, hemos encontrado una considerable recuperación espontánea ocurre que se opone a la evaluación del comportamiento a largo plazo de las terapias con accidente cerebrovascular durante 8 semanas. Por el contrario, se muestra que la MCAO distal con el tándem CCA oclusión induce déficit a largo plazo en ratas de edad avanzada.

En conclusión, este procedimiento en ratas provoca los movimientos que son similares en tamaño y ubicación a los observados en la condición humana, con discapacidad sostenida que se puede utilizar para permitir el ensayo de nuevos tratamientos y elucidación de remecanismos par después del accidente cerebrovascular isquémico.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carprofeno	Norbrook	Vm No; 02000/4229	dar 0,25 mg/kg
Sulfato de atropina	AmTech	RXATRINJ-100
Hisopos con alcohol	UHS	20021
Crema de lidocaína (Emla)	AstraZeneca	0012901	Aplique una gota del tamaño de un guisante en el cuello afeitado y las regiones temporales
Sistema de manta homeotérmica	Instruments	507222F
Pinzas	Fine Science Tools	11019-12
Isoflurano	Abbott	B506
Suturas de seda	Harvard Apparatus	723288
Sistema de cauterización	Eschmann
0,25 mm Pinza de cauterización	Eschmann	8330349
fina Pinzas Dumont		11251-10
			goteo salino accionado por pulgar
Sistema de aspiración Vacusafe	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
	acero recubiertas de diamante grueso de 1,6 mm	K801 104 016
Taladro dental de mano	NSK	NSKVMAXVRE (Pieza de mano NSKEX6B)
Tijeras de resorte Vannas	Herramientas	de ciencia fina15000-03
Tijeras microvasculares	World Precision Instruments	501790
4-0 Suturas de Vicryl	Ethicon
Clip y aplicador
vascular Microscopio quirúrgico	Zeiss
anestesia compacto Isoflurano K/F Gas único	Soluciones VetTech
Acero al carbono Hojas de bisturí Nº 10	Swann-Morton	201
Agujas de 25 g Jeringas	Terumo	NN-2525R
(1 ml y 5 ml)	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
Solución salina (cloruro de sodio 0,9%)	Fresenius Kabi	Pl 08828/0178
bastoncillos de algodón	Johnson and Johnson	5000207582502	esterilizar antes de usar
la gasa			esterilizar antes de usar
Paquete de imágenes médicas (Jim)	Xinapse		Software gratuito
Software de mapeo estadístico paramétrico (SPM8)	UCL		Software gratuito
Software de análisis de energía (G * Power)	Universitä t Dü sseldorf		Software libre