En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.
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Artículo de método
Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca
En este artículo
Resumen
Resumen
< clase p = 'jove_content'>El manejo del retículo sarcoplasmático (SR) Ca2+ juega un papel clave en el acoplamiento normal de excitación-contracción y se sabe que el manejo aberrante de SRCa 2+ juega un papel importante en ciertos tipos de arritmia. Debido a que las arritmias son fenómenos emergentes espacialmente distintos, deben investigarse a nivel tisular. Sin embargo, los métodos para sondear directamente SR Ca2+ en el corazón intacto siguen siendo limitados. Este artículo describe el protocolo para el mapeo óptico dual del potencial transmembrana (Vm) y el intra-SR libre [Ca2+] ([Ca2+]SR) en el corazón de conejo perfundido por Langendorff. Este enfoque aprovecha el indicador de Ca2+ de baja afinidad Fluo-5N, que tiene una fluorescencia mínima en el citosol donde el [Ca2+] ([Ca2+]i intracelular) es relativamente bajo, pero exhibe una fluorescencia significativa en el lumen SR donde [Ca2+]SR está en el rango milimolar. Además de revelar las características espaciales de SR Ca2+ a través de la superficie epicárdica del corazón, este enfoque tiene la clara ventaja de la monitorización simultánea de Vm, lo que permite investigar la relación bidireccional entre Vm y SR Ca2+ y el papel de SR Ca2+ en los fenómenos arritmogénicos.
Introducción
El mapeo óptico dual del Ca2+ intracelular y el potencial transmembrana (Vm) en el corazón intacto perfundido por Langendorff se ha convertido en un pilar de las investigaciones en electrofisiología cardíaca, incluidos los mecanismos de arritmia y el acoplamiento excitación-contracción1-4. Este enfoque ha proporcionado un conocimiento sin precedentes sobre la electrofisiología normal y anormal y, lo que es más importante, sobre la relación bidireccional entre Vm y Ca2+ intracelular. Sin embargo, el mapeo óptico de Ca2+ intracelular con indicadores fluorescentes de alta afinidad (como Rhod-2 y Fluo-4) so....
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis, y se adhirieron a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicado por los Institutos Nacionales de Salud.
1. Preparación
- Prepare dos concentrados (25X) los stocks de solución de Tyrode modificada por adelantado y se almacena a 4 ° C: (1) de la I (en mM: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117.5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26.25) y (2) de la II (en mM: NaHCO3 500).
- Recién preparar la solución de 2 L Tyrode de la siguiente c....
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Resultados
La figura 1A muestra un diagrama esquemático de la configuración óptica para la doble V m y SR Ca 2+ mapeo. Con esta configuración, no hay separación espectral completa de la V my SR Ca 2 + señales (Figura 1B). Un diagrama del sistema de perfusión de doble bucle utilizado para Fluo-5N colorante de carga se ilustra en la Figura 1C. Figura 1D muestra la orientación horizontal del corazón en el plato de perfusión.......
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Discusión
Las claves del éxito Fluo-5N colorante de carga son la configuración de perfusión de recirculación de pequeño volumen, lo que permite una alta concentración Fluo-5N sin la necesidad de grandes cantidades de colorante, la longitud de tiempo de carga (1 hr), y la realización de la carga a TA. Si la carga se realiza a temperaturas fisiológicas, la actividad enzimática celular rápidamente escinde la etiqueta -AM cuando el colorante atraviesa la membrana celular, atrapando las moléculas de colorante en el citosol y no lo que.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (R01 HL 111600) y la Asociación Americana del Corazón (12SDG9010015).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Componente de la solución de Tyrode |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Componente de la solución de Tyrode |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Componente de la solución de Tyrode |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Componente de la solución de Tyrode |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | Componente de la solución de Tyrode |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | Componente de la solución de Tyrode |
| D-Glucosa | Fisher Scientific | D16-1 | Componente de la solución de Tyrode |
| 95% O2 5% CO2 | AirGas | carbógeno | Para la oxigenación y el pH de la solución de Tyrode |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | Desacoplador de excitación-contracción |
| RH237 | Biotium | 61018 | Colorante sensible al voltaje |
| Fluo-5N AM | Invitrogen | F-26915 | Indicador Ca2+ de baja afinidad; Alternativa: Invitrogen F-14204; La carga debe realizarse a temperatura ambiente |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | Para la carga del indicador Ca2+; Calentar hasta que la solución esté clara antes de usar |
| Sulfóxido de dimetilo (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Para disolver blebbistatina y colorantes |
| Filtro | EMD Millipore | NY1104700 | 11 μ m filtro en línea |
| Transductor de presión | WPI | BLPR2 | Para medir la presión de perfusión |
| Transbridge Transductor Amplificador | WPI | SYS-TBM4M | Para transducir/amplificar la señal de presión; PowerLab también se puede utilizar con los instrumentos BioAmp |
| PowerLab 26T | ADInstruments | para el registro continuo de señales de presión y ECG | |
| THT Macroscope | SciMedia | Configuración óptica macroscópica. Detalles: Objetivo 0,63X (NA = 0,31), objetivo de condensación 2X, campo de visión resultante = 3,1 cm x 3,1 cm, profundidad de enfoque = ~ 1,5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Cámaras de mapeo óptico | |
| Precision LED Spot Light Mightex | PLS-0470-030-15-S | Fuente de luz LED |
Referencias
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells. tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circulation research. 95, 21-33 (2004).
- Lou, Q., Li, ....
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Reimpresiones y permisos
