La espectrometría de masas de tiempo de vuelo/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) y las técnicas moleculares (secuenciación del gen 16S rRNA) permiten la identificación de patógenos bacterianos raros en diagnósticos rutinarios. El objetivo de este protocolo radica en la combinación de ambas técnicas que conduce a datos más precisos y confiables.
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Artículo de método
La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS
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Resumen
Resumen
Hay un número de patógenos bacterianos raras y, por lo tanto, se ha descrito suficientemente que se presentan para causar infecciones graves, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. En la mayoría de los casos, sólo unos pocos datos, publicados en su mayoría como informes de casos, los cuales están disponibles investigar el papel de los agentes patógenos tales como un agente infeccioso. Por lo tanto, con el fin de aclarar el carácter patógeno de tales microorganismos, es necesario llevar a cabo estudios epidemiológicos que incluyen un gran número de estas bacterias. Los métodos utilizados en un estudio de este tipo de vigilancia tienen que cumplir los siguientes criterios: la identificación de las cepas ha de ser precisa, según la nomenclatura válida, deben ser fáciles de manejar (robustez), económico en el diagnóstico de rutina y tienen que generar comparables resultados entre diferentes laboratorios. En general, hay tres estrategias para la identificación de cepas bacterianas en condiciones de rutina: 1) la identificación fenotípica caracterizar la Biochemical y metabólicas propiedades de las bacterias, 2) técnicas moleculares, tales como la secuenciación de genes 16S rRNA y 3) la espectrometría de masas como un enfoque basado en la novela proteoma. Desde espectrometría de masas y enfoques moleculares son las herramientas más prometedoras para la identificación de una gran variedad de especies bacterianas, se describen estos dos métodos. Se discuten los avances, limitaciones y problemas potenciales cuando se utilizan estas técnicas.
Introducción
Identificación segura de patógenos raras en el diagnóstico de rutina se ve obstaculizada por el hecho de que los métodos de cultivo y bioquímicos clásicos son engorrosos y, a veces cuestionable. Además, un laboratorio de microbiología de diagnóstico tiene que procesar un gran número de patógenos, que van desde unos pocos cientos a varios miles, a diario, lo que requiere el uso de sistemas automatizados. Además de la gestión de un diario de alto rendimiento, se necesita la identificación precisa de especies bacterianas. Esto se justifica ya que difieren en su patrón de susceptibilidad antimicrobiana y, por tanto, la identificación correcta proporciona al médico inform....
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Protocolo
1. Extracción de ADN bacteriano
- Preparación de la solución PBS
- Pesar 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2 H 2 O y 8,80 g de NaCl en un matraz y llenar con agua destilada hasta un volumen final de 1.000 ml. Ajustar el pH a 7,4. Para uso final filtrar la solución a través de una prueba de bacterias (0,22 m) de filtro.
- Las bacterias Extracción de ADN de bacterias Gram-negativas
- Streak el material del paciente en un medio de cultivo apropiado (por ejemplo, Columbia agar sangre), identificar y aislar los patógenos potenciales.
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Resultados
MALDI-TOF MS es una novela, método rápido y barato para el diagnóstico de rutina microbiológicos. La identificación de especies bacterianas mediante MALDI-TOF MS produce espectros compuesto principalmente de proteínas ribosomales, sino también otras proteínas muy conservadas "con funciones de mantenimiento de la casa afectadas en grado mínimo y por las condiciones ambientales" .El 17 de la base de datos de este MMIS contiene un amplio conjunto de espectros de referen.......
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Discusión
Tanto MALDI-TOF MS y la secuenciación de genes 16S rRNA ofrecen la posibilidad de identificar un gran número de diferentes bacterias. MALDI-TOF MS es un método rápido y barato, que es fácil de manejar y de grandes bases de datos de espectros de masa bacteriana están disponibles. Por esta razón, MALDI-TOF MS es un método eficaz y fiable rápida, el costo de llevar a cabo estudios de cribado se centraron en patógenos bacterianos raras 17,20,39,51. En un estudio prospectivo comparando MALDI-TOF MS con otros métod.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Prof. Enno Jacobs por su continuo apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CHROMASOLV, agua de grado HPLC, 1 L | Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Alemania | 270733 | |
| Lyser de tejidos LT | Qiagen, Hilden, Alemania | 85600 | Homogeneizador oscilante |
| Perlas de vidrio 1,0 mm | VWR International, Darmstadt, Alemania | 412-2917 | |
| Thermomixer 5436 | Eppendorf, Hamburgo, Alemania | 2050-100-05 | |
| QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen, Hilden, Alemania | 51306 | |
| Kit de núcleo de PCR Taq (1.000 U) | Qiagen, Hilden, Alemania | 201225 | |
| Imprimación delantera TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') | biomers.net, Ulm, Alemania | - | |
| Imprimación inversa RTU4 (5&agudo;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&agudo;) | biomers.net, Ulm, Alemania | - | |
| Mastercycler | Eppendorf, Hamburgo, Alemania | - | Termociclador |
| Tubo de reacción 1,5 ml | SARSTEDT, Nü mbrecht, Alemania | 72.692 | |
| Tubo de reacción 2 ml | SARSTEDT, Nü mbrecht, Alemania | 72.693.005 | |
| PCR 8er-CapStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania | 711040X | |
| PCR 8er-SoftStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania | 711030X | |
| Sharp R-ZV11 | Sharp Electronics, Hamburgo, | Alemania-Microondas | |
| Titriplex III (EDTA Na2-sal deshidratada; 1 kg) | Merck, Darmstadt, Alemania | 1084211000 | |
| SeaKem LE Agarose | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania | 849006 | |
| SmartLadder SF - 100 a 1.000 bp | Eurogentec, Lü ttich, Bélgica | MW-1800-04 | |
| Azul de bromofenol (25 g) | Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Alemania | B0126 | |
| Xileno cianol FF (10 g) | Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Alemania | X4126 | |
| ComPhor L Maxi | Biozym, Hessisch Oldendorf, | Alemania-Solución | |
| de bromuro de etidio al 1% (10 ml) | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | 2218.1 | |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad Laboratories, Mü nchen, | Alemania-Gel-sistema de documentación | |
| ExoSAP-IT (500 reacciones) | Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Reino Unido | 78201 | |
| Buffer (10x) con EDTA | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 402824 BigDye | |
| Terminator Kit v1.1 | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 4337450 | |
| Formamida Hi-Di (25 ml) | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 4311320 | |
| Kit de giro DyeEx 2.0 (250) | Qiagen, Hilden, Alemania | 63206 | |
| 3130 Analizador genético | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | - | Secuenciador |
| MicroAmp placa de reacción óptica de 96 pocillos con código de barras | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 4306737 | |
| 3130 Analizador genético, base de placa de 96 pocillos | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 4317237 | |
| 3130 Analizador genético, retenedor de placa de 96 pocillos | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 4317241 | |
| 3130 Analizador genético, pocillo septos de placa | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 4315933 | |
| 3130 Analizador Genético, Polímero POP-7, 7 ml | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 4352759 | |
| 3130 Analizador Genético, Matriz de 4 Capilares, 50 cm | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | 4333466 | |
| Software de análisis de secuenciación 5.4 | Life Technologies, Darmstadt, Alemania | - | |
| microflex | Bruker Daltonik, Bremen, | Alemania-Nuestro | mMIS |
| VITEK MS | bioMé rieux, Nü rtingen, Alemania | 2nd mMIS | |
| flexControl 3.4 | Bruker Daltonik, Bremen, | Alemania-Software | control de dispositivos |
| Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) | Bruker Daltonik, Bremen, Alemania-Software | análisis | |
| α-ácido ciano-4-hidroxicinámico, HCCA, 1 g | Bruker Daltonik, Bremen, Alemania | 201344 | |
| Norma de calibración de péptidos II | Bruker Daltonik, Bremen, Alemania | 222570 | |
| MSP 96 blanco acero pulido | Bruker Daltonik, Bremen, Alemania | 8224989 | |
| peqGREEN | peqlab | 37-5010 | |
| MALDI Biotyper Galaxy | Bruker Daltonik, Bremen, Alemania | Nº de pieza 1836007 | Sistema automatizado de preparación de muestras |
| Vitek 2 | bioMé rieux, Nü rtingen, Alemania | Nuestro aMIS | |
| MicroScan | Beckman Coulter, Krefeld, Alemania | 2nd aMIS | |
| BD Phoenix™ Sistema Automatizado de Microbiología | BD, Heidelberg, Alemania | 3rd aMIS | |
| i>Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923&comercio;) | Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), LGC Standards, Molsheim, Francia | Control positivo para PCR |
Referencias
- Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
- Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
- Adekambi, T., Drancourt, M., Raoul....
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Reimpresiones y permisos
