Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Resumen

Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.

Resumen

Mitocondrias del músculo esquelético disfuncionales juegan un papel en el metabolismo alterado observado con el envejecimiento, la obesidad y la diabetes tipo II. Ensayos respirométricos mitocondrial de preparaciones mitocondriales aislados permiten la evaluación de la función mitocondrial, así como la determinación del mecanismo (s) de acción de los fármacos y las proteínas que modulan el metabolismo. Procedimientos de aislamiento actuales requieren a menudo grandes cantidades de tejido para producir las mitocondrias de alta calidad necesarias para los ensayos de respirométricos. Los métodos presentados en este documento describen cómo de alta calidad mitocondrias purificadas (~ 450 g) se puede aislar a partir de cantidades mínimas (~ de 75-100 mg) de músculo esquelético de ratón para su uso en mediciones respiratorias de alto rendimiento. Se determinó que nuestro método de aislamiento produce 92,5 ± 2,0% mitocondrias intactas midiendo la actividad de la citrato sintasa espectrofotometría. Además, el análisis Western blot en mitocondrias aisladas resultó en la expresión débil del cytosoproteína lic, GAPDH, y la expresión robusta de la proteína mitocondrial, COXIV. La ausencia de una banda de GAPDH prominente en las mitocondrias aisladas es indicativo de poca contaminación de fuentes no mitocondriales durante el procedimiento de aislamiento. Lo más importante, la medición de la tasa de consumo de O ₂ con tecnología basada en micro-placa y la determinación de la relación del control respiratorio (RCR) para los ensayos de respirométricos acoplado muestra altamente acoplado (RCR;> 6 para todos los ensayos) y las mitocondrias funcionales. En conclusión, la adición de una etapa de picar carne separada y reduciendo significativamente impulsado por motor de velocidad homogeneización de un método reportado previamente ha permitido el aislamiento de alta calidad y mitocondrias purificada a partir de cantidades más pequeñas de ratón músculo esquelético que da como resultado en las mitocondrias altamente acoplados que respiran con alta función durante ensayos respirometirc basado en una microplaca.

Introducción

La función principal de las mitocondrias es producir ATP a partir de la fosforilación oxidativa. Sin embargo, las mitocondrias tienen muchas otras funciones celulares importantes, que incluyen, entre otras: la producción y desintoxicación de especies reactivas de oxígeno, la regulación del calcio citoplasmático y mitocondrial, el tráfico de orgánulos, la homeostasis iónica y la participación en la apoptosis^1,2. Por lo tanto, no es de extrañar que las mitocondrias disfuncionales desempeñen un papel en muchas patologías patológicas, como el envejecimiento, las enfermedades neurodegenerativas, las enfermedades cardiovasculares, el cáncer, la obesidad y la diab....

Protocolo

Los estudios en animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión en el Instituto Politécnico de Virginia y la Universidad Estatal.

1. Configuración (Tiempo: ~ 45 min)

1. Tiendas Descongele de 0,25% de tripsina, Aislamiento Buffer de mitocondrias (IBM) 1 y IBM2 en un baño de agua a 37 ° C.
2. Enjuague la cristalería y los instrumentos de disección en etanol al 70%, seguido de agua de alta pureza.
3. Preparar una solución de tripsina al 0,05% desde 0,25% de tripsina stock de diluir 1 parte de tripsina en 4 partes IBM1.
4. Mezclar proteasa e inhibidor....

Resultados

La actividad de la citrato sintasa sirve como medida para la integridad de la membrana desde la citrato sintasa se ​​encuentra en la membrana mitocondrial interna, y por lo tanto no debe estar presente en las suspensiones de las mitocondrias con membranas intactas. La figura 1 representa la actividad de la citrato sintasa en muestras no se sonicaron mitocondriales en comparación con sonicado muestras de la misma aislamiento. Sonicando los resultados mitocondrias en un aumento estadísticamente significat.......

Discusión

Los métodos presentados en este documento proporcionan una descripción detallada de un procedimiento de aislamiento mitocondrial a partir de cantidades mínimas (~ de 75-100 mg) de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento de aislamiento es capaz de producir de alto funcionamiento, las mitocondrias pura (~ 450 g) como lo demuestra O ₂ tasas de consumo, valores RCR, máxima actividad de la citrato sintasa y de expresión de proteínas de inmunotransferencia. Es importante destacar que las mitocondrias aisla.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Esencialmente graso	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Libre de ácido- BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Sacarosa	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Manitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Cloruro de sodio Cristales blancos o polvo cristalino ≥ 99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Dodecil sulfato de sodio	Sigma Aldrich	L3771	N/A
Desoxicolato de sodio	Sigma Aldrich	D6750	N/A
Éter de polioxietileno (12) nonilfenil, ramificado	Sigma Aldrich	238651	N/A
Hojas de afeitar de un solo filo	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Coladores de células de nailon	Fisher Scientific	352360	N/A
Stop Proteasa & Cóctel de inhibidor de fosfato Thermo	Scientific	1861284	N/A
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con tapón de rosca	Thermo Scientific	3474	N/A
Perlas de óxido de circonio	Fisher Scientific	C9012112	N/A
Anticuerpo GAPDH (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A Anticuerpo
Anti-COXIV	Señalización Celular	4844s	Cualquier proteína de la membrana interna mitocondrial será suficiente
Peroxidasa conjugada affinipure Burro, Anti Conejo IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N/A
Peroxidasa conjugada affinipure Cabra, Anti Ratón IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA Protein Kit	Thermo Scientific	23225	N/A
Ácido pirúvico, 98%	Sigma Aldrich	107360	Almacenar en 4 & grados; C, pH a 7.4 con KOH antes de usar en el ensayo respirométrico
Ácido succínico	Sigma Aldrich	S9512	Almacene a temperatura ambiente, pH a 7.4 con KOH antes de usar en el ensayo respirométrico
L(-) Ácido málico, BioXtra, ≥ 95%	Sigma Aldrich	M6413	Almacenar a temperatura ambiente, a 7.4 con KOH antes de usar en el ensayo respirométrico
Ácido L-glutámico	Sigma Aldrich	G1251	Almacenar a temperatura ambiente, a 7.4 con KOH antes de usar en el ensayo respirométrico, a 7.4 con KOH antes de usar en el ensayo
Palmitoil Cloruro de L-carnitina	Sigma	Aldrich P1645	Almacenar a -20 °C
Oligomicina A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Tienda a -20 ° C
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)	Sigma Aldrich	C2920	Almacenar en 2-8 ° C
fenilhidrazona
≥ 98% (TLC), polvo [FCCP]
Antimicina A de streptomyces sp.	Tienda Sigma Aldrich	A8674	a -20 ° C
Adenosina 5′-difosfato sal monopotásica deshidratada [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Almacenar en -20 ° C, hasta 7,4 con KOH antes de su uso en el ensayo
Rotenona	Sigma Aldrich	R8875	Almacenar a temperatura ambiente

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