Neuronal Tracing en explantes cerebrales guiadas por láser

Summary

Describimos una técnica para etiquetar las neuronas y sus procesos a través de anterógrada o retrógrada trazadores inyecciones en núcleos cerebrales utilizando una preparación in vitro. Hemos modificado un método existente de i n vitro electroporación trazador mediante el aprovechamiento de la etiqueta fluorescente mutantes de ratón y equipo óptico básica con el fin de aumentar la precisión de etiquetado.

Abstract

Se presenta una técnica que combina un protocolo de inyección vitro trazador en, que utiliza una serie de pulsos eléctricos y de presión para aumentar la absorción de colorante a través de la electroporación en explantes cerebrales con iluminación láser específica y que emparejan gafas de filtro durante el procedimiento. La técnica descrita de electroporación in vitro por sí mismo rendimientos relativamente buen control visual para que apuntan a ciertas áreas del cerebro. Al combinar con excitación láser de marcadores genéticos fluorescentes y su lectura a través de gafas de filtro de banda de paso, que puede recoger las emisiones de las marcadas genéticamente células / núcleos y el tinte de rastreo fluorescente, un investigador puede aumentar considerablemente la precisión de las inyecciones encontrando el área de interés y el control para el tinte de difusión / absorción en la zona de inyección de forma mucho más eficiente. Además, la técnica de iluminación láser permite estudiar la funcionalidad de un neurocircuit propuesta por provIding información sobre el tipo de neuronas que se proyectan a una cierta área en casos en que la expresión de GFP está relacionada con el tipo de transmisor expresada por una subpoblación de neuronas.

Introduction

Con el fin de definir un cierto (micro) circuito neuronal, hay que empezar por encontrar los diversos participantes de dicho circuito, y su patrón de conexión. Desde la publicación de Waller sobre neurofiber rastreo a través lesioning ¹ una gran variedad de técnicas de rastreo neuroanatómicas ha sido establecida. Algunas de estas técnicas se pueden aplicar en el tejido fijado post mortem ^2-4, otros se basan en el transporte activo del colorante en neuronas vivas, como descubierto en 1971 ^6.5. Este último puede subdividirse en dos grupos que discriminan entre los métodos que se aprovechan de retrógrado activo (a partir de la zona de in....

Protocol

1. Genotipado óptico

1. óptico Genotipado de Ratón cachorros

1. Compruebe para la expresión de la respectiva marcador fluorescente usando un puntero de láser de la longitud de onda de excitación apropiada (405 nm en los experimentos descritos aquí) y los correspondientes filtros de gafas que bloquean la longitud de onda de excitación, pero que pasa a la longitud de onda de emisión (450 - 700 nm en los experimentos descritos aquí) . Apunte el puntero láser en la parte posterior de la cabeza o la médula espinal de las crías de ratón (ver Figura 1). Evite que brilla el láser en los ojos y la exposición ....

Results

Las figuras 1 y 2 muestran como el puntero láser y gafas láser se puede utilizar para determinar el genotipo de forma rápida y económica animales positivos GFP de una camada. En los casos de los cachorros de ratón, la técnica se puede utilizar para identificar de forma no invasiva etiqueta GFP en los cerebros de los animales a través del cráneo y la piel suprayacente (Figura 1A - D). Fluorescencia emitida se puede ver a través de la piel y el cráneo de crías de ratón po.......

Discussion

Una fuerza general de la electroporación in vitro trazador, a diferencia de los estudios in vivo de rastreo, es que se da a los investigadores un mejor acceso a la zona del cerebro de interés y por lo tanto, no implica estereotáctica caro (y, a menudo electrofisiológico) equipo. Además, el período de supervivencia necesario para los explantes cerebrales se extiende sólo unas pocas horas (1 - 4) en lugar de días o incluso semanas en el caso de in vivo inyecciones de trazador (ver una revisión d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Todos los productos químicos son de Sigma-Aldrich, a menos que se indique lo contrario.
Cloruro de potasio		P9333
Fosfato de potasio monobásico		P5655
Fosfato de sodio di-básico		S907
Cloruro de		M2670
Cloruro de		C5080
Glucosa		G7528
Bicarbonato		S6297
Ácido		A4544
Mioinositol		I5125
Piruvato		P2256
	sérica bovina	A2153	opcional, para (inmuno)histoquímica adicional
Triton-X-100		X100	opcional, para (inmuno)histoquímica adicional
Poli(etilenglicol), 8000 MW		P2139	opcional, para la limpieza del cerebro
Formamida	Fisher Scientific	F84	opcional, para la limpieza del cerebro
Cólera subunidad-b	Sondas moleculares	C-34776 (Alexa 555)
Sondas moleculares	tetrametil-rodamina de dextrano	D-7162 (Alexa 555)
Fluorescente Nissl	Invitrogen	N-21479 (azul)	opcional
Paraformaldehído	Fisher Scientific	SF93
Agarose	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
Filamentos de vidrio de borosilicato	Harvard Apparatus	G150F-10
Extractor de pipetas	Zeitz Instruments, Alemania	DMZ Extractor
Configuración de perfusión	Puntero láser hecho a
	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
Filtro/gafas de seguridad	Dragon Lasers, China	LSG09 (paso de banda 450-700 nm)
Microscopio bionocular	Wild Heerbrugg, Suiza	Wild M3	Equipado con iluminador de alta intensidad (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC con el software MC Stimulus instalado	Sistemas multicanal, Alemania (software)
Estimulador de 2 canales	Sistemas multicanal, Alemania	STG-1002
Unidad de aislamiento de estimulación	A.M.P.I., Israel	Micromanipulador Iso-Flex
	Narishige, Japón	YOU-1
Vibratome	Leica, Alemania	VT1000S