Mediante el injerto de perlas empapadas en factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización en embriones en desarrollo, es posible probar directamente sus efectos in vivo. En este protocolo, las perlas se injertan en la yema de la extremidad para determinar los efectos de estas moléculas en la expresión génica y la transducción de señales.
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Artículo de método
Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica
En este artículo
Resumen
Resumen
El uso de embriones de pollo es posible probar directamente los efectos de cualquiera de los factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización sobre la expresión génica y la activación de vías de transducción de señal. Esta técnica permite la entrega de moléculas de señalización en las etapas de desarrollo definidas con precisión para momentos específicos. Después de esto, los embriones pueden ser cosechadas y examinaron la expresión de genes, por ejemplo mediante hibridación in situ, o activación de las vías de transducción de señales observados con la inmunotinción.
En vídeo perlas de heparina empapados en FGF18 o AG perlas 1-X2 empapados en U0126, un inhibidor de MEK, están injertados en el esbozo de la extremidad in ovo. Esto demuestra que FGF18 induce la expresión de MyoD y la fosforilación de ERK y la expresión MyoD tanto endógenas como inducida FGF18 es inhibida por U0126. Cuentas empapados en un antagonista del ácido retinoico pueden potenciar la inducción prematura MyoD por FGF18.
Este enfoque puede ser nosotrosed con una amplia gama de diferentes factores de crecimiento e inhibidores y se adapta fácilmente a otros tejidos en el embrión en desarrollo.
Introducción
Embriones de aves han proporcionado una poderosa herramienta para el estudio del desarrollo durante muchos años 1. Una de sus características más útiles es que son relativamente fáciles de manipular. Desarrollo externo hace que sea posible abrir el huevo para acceder al embrión y realizar diversas micromanipulaciones incluyendo ejemplos tales como el sistema quimera codorniz-chick clásico para estudiar el destino celular 2,3, la inyección de los retrovirus para la sobreexpresión en tejidos específicos durante el desarrollo 4,5 y la cultura explante para identificar las fuentes de señalización de desarrollo 6. Más recienteme....
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Protocolo
Declaración de Ética: Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y las directrices éticas de la Universidad de Nottingham.
1. Preparación de perlas de heparina para Injerto
- Lávese las perlas de heparina a fondo en PBS antes de su uso. Nota: los granos se pueden almacenar a 4 ° C como una suspensión en PBS.
- Seleccione los granos para el injerto por sacarlos de la población con una pipeta de 20 l en una gota 1 ml de PBS. A continuación, utilice una micropipeta establece en 2 l para transferir perlas en una gota 20 l de PBS en una placa de Petri 3 cm. Elija cuentas basadas en el tamaño y, ....
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Resultados
En la etapa HH 21 MyoD no se expresa en el desarrollo de las extremidades mioblastos aunque la tinción se puede ver en la miotoma de los somitas en desarrollo (Figura 1A). La Figura 1B muestra la hibridación in situ para MyoD 6 hr después de un injerto de talón FGF18. MyoD se induce en mioblastos cercanos a la perla, mientras que no hay expresión en el miembro contralateral. Co-injerto de un grano empapado en U0126, un inhibidor específico de MEK, bloques FGF18 inducción de Myo.......
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Discusión
El uso de injertos de cuentas aplicados directamente al desarrollo de tejidos in ovo es una herramienta poderosa para diseccionar el papel de la señalización del factor de crecimiento durante el desarrollo dando un control sin precedentes sobre el estado de desarrollo en que se aplican y la duración de la exposición.
La elección del talón para cada tipo de molécula es importante. Moléculas hidrofóbicas pequeños, tales como los inhibidores aquí descritos y el ácido retinoico, por lo general s.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado en parte por un premio de la Universidad de Nottingham a DS. La RM está financiada por el Comité Superior para el Desarrollo de la Educación de Iraq.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Perlas acrílicas de heparina | Sigma | H5263 | Las perlas acrílicas de heparina utilizadas han sido descontinuadas. Sin embargo, hay un producto de reemplazo disponible, perlas de heparina y agarosa, n.º de gato H6508. Son transparentes, por lo que es más difícil trabajar con ellos, pero se pueden teñir con rojo fenol de la misma manera que las cuentas AG 1-X2,Cuentas |
| AG 1-X2 | Bio-Rad | 140-1231 | |
| Affi Gel cuentas azules | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | Estas perlas se han utilizado con una variedad de factores de crecimiento, incluidos Shh y FGF, y se pueden usar para reemplazar las perlas de heparina |
| FGF18 | Peprotech | 100-28 | Vuelva a suspender en PBS con 0/1% de BSA, prepare alícuotas de un solo uso de 0.5-1ul y almacene a -80 ° C. Los lotes y los proveedores pueden variar, por lo que se deben probar diferentes concentraciones para determinar una dosis efectiva. |
| U0126 | Señalización celular | 9903 | Hacer hasta 20mM de stock en DMSO y almacenar en alícuotas de un solo uso a -80°C. Proteger de la luz. |
| BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspender en DMSO y almacenar en alícuotas de un solo uso a -80°C. Proteger de la luz. |
| Tinta china negra | Windsor y Newton | 5012572003384 (30 ml) | Aunque existen alternativas a este producto, se debe tener cuidado ya que algunas tintas son tóxicas para los embriones |
| Alambre de tungsteno, 0,1 mm de diámetro. 99,95% | Alfa Aesar | 10404 | |
| Penicilina / estreptomicina | Sigma | P0781 | Diluido 100X en PBS/tinta y PBS/FCS |
Referencias
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (....
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Reimpresiones y permisos
