Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.
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Artículo de método
La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
Las imágenes in vivo proporcionan un acceso sin precedentes al comportamiento dinámico de las estructuras celulares y subcelulares en su contexto natural. La realización de tales experimentos de imagen en vertebrados superiores, como los mamíferos, generalmente requiere acceso quirúrgico al sistema en estudio. La accesibilidad óptica del pez cebra embrionario y larvario permite eludir estos procedimientos invasivos y permite obtener imágenes del organismo intacto. De hecho, el pez cebra es ahora un modelo bien establecido para visualizar comportamientos celulares dinámicos utilizando microscopía in vivo en una amplia gama de contextos de desarrollo, desde la proliferación hasta la migración y la diferenciación. Un desarrollo más reciente es el uso cada vez mayor del pez cebra para estudiar eventos subcelulares, incluido el tráfico mitocondrial y la dinámica del centrosoma. La relativa facilidad con la que estas estructuras subcelulares pueden ser marcadas genéticamente por proteínas fluorescentes y el uso de técnicas de microscopía óptica para obtener imágenes de ellas está transformando al pez cebra en un modelo in vivo de biología celular. Aquí describimos métodos para generar construcciones genéticas que marquen orgánulos de manera fluorescente, destacando las mitocondrias y los centrosomas como ejemplos específicos. Utilizamos el sistema bipartito Gal4-UAS en múltiples configuraciones para restringir la expresión a tipos específicos de células y proporcionar protocolos para generar peces transgénicos estables y que se expresan transitoriamente. Finalmente, proporcionamos pautas para elegir los métodos de microscopía óptica que son más adecuados para obtener imágenes de la dinámica subcelular.
Introducción
En imágenes in vivo proporciona una visualización directa de los comportamientos celulares en el contexto más fisiológica. La transparencia de los embriones de pez cebra, su rápido desarrollo y externa y una rica variedad de herramientas genéticas que permiten el marcaje fluorescente, han contribuido a la creciente utilización de la microscopía in vivo para dilucidar la dinámica de eventos de desarrollo claves. Los estudios de imágenes del desarrollo del sistema nervioso en el pez cebra tienen, por ejemplo, se expandió enormemente nuestro conocimiento del comportamiento de las células progenitoras neurales y el destino de su progenie, inclu....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones locales del gobierno de la Alta Baviera (Munich, Alemania).
1. Etiquetado de orgánulos subcelulares y Otras Estructuras
NOTA: Aquí reportero construye genética que se describen membranas centrosomas etiqueta fluorescente, las mitocondrias y los teléfonos.
- Utilizar métodos de clonación convencionales 29 para generar proteínas de fusión que etiquetan con fluorescencia centrosomas y mitocondrias. Clonar la secuencia de codificación de centrin4 pez cebra (cetn4) en marco con una proteína fluores....
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Resultados
Aquí el uso de campo amplio y microscopía confocal para las mitocondrias de imagen y los centrosomas en embriones de pez cebra que vive está directamente comparado y contrastado. Dependiendo de la localización de las células en las que la dinámica de orgánulos han de ser examinada y la frecuencia propia de los acontecimientos subcelulares específicos, por lo general, ya sea de campo amplio o microscopía confocal es la mejor opción. Nos fotografiado orgánulos en las neuronas RB situados e.......
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Discusión
Aquí, se demuestra la versatilidad del sistema de expresión Gal4-UAS a las mitocondrias de la etiqueta fluorescente, centrosomas y las membranas celulares de tipos de células específicas in vivo en embriones de pez cebra. Muchas proteínas de fusión fluorescentes que etiquetan otros orgánulos o estructuras subcelulares se pueden encontrar en la literatura publicada y se pueden obtener en el laboratorio respectivo, de fuentes comerciales o depositarios plásmido no comerciales (por ejemplo, Addgene). Para.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
P.E. cuenta con el apoyo del Grupo de Formación en Investigación 1373 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) y la Escuela de Graduados de la Technische Universität München (TUM-GS). G.P. contó con el apoyo de TUM-GS. L.T. cuenta con el apoyo de una beca EMBO (EMBO ALTF 108-2013). El trabajo de D.P. sobre el pez cebra fue apoyado por la DFG a través del Sonderforschungsbereich "Mecanismos moleculares de la neurodegeneración" (SFB 596); el Centro para las Ciencias Integradas de las Proteínas (Múnich) y el Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7/2007-2013) en virtud del acuerdo de subvención n.º 200611 (MEMOSAD). Actualmente es becario de la Fundación de....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa (2-hidroxietilagirasa) | Sigma-Aldrich | A4018-10G | Baja temperatura de gelificación Tipo VII |
| Calentador de bloque | Eppendorf | Thermomixer compacto | |
| Ca(NO3)2 Nitrato de calcio hidratado, 99,996% | Aldrich | 202967-50g | Para preparar 30x Cámara CCD de Danieau |
| Qimaging | Retiga Exi Fast 1394 | ||
| Revestimiento cerámico Pinzas Dumont #5 | Dumont - Fine Science Tools | 11252-50 | #5 Pinzas |
| Microscopio de barrido láser confocal | Olympus | FV1000 Fluoview | |
| Culture Calentador de platos | Warner Instrument Corporation | DH-35 | Anillo calefactor |
| Sal de metanosulfato de etilo 3-aminobenzoato | PharmaQ | Tricaine PharmaQ-25g | Tricaine (anestésico) |
| Microscopio de disección de fluorescencia | Leica | M205 FA | |
| GeneClean kit | MP Biomedicals | 111001200 | |
| Placas de cultivo con fondo de vidrio | MatTek Corporation | P35G-0-14-C Placa de | Petri de 35 mm, micropocillo de 14 mm, cubreobjetos n.º 0 |
| Agujas de vidrio | World Precision Instruments Inc. | TW100F-4 | Para microinyecciones |
| HEPES | Sigma | H3375-250g | Para preparar 30x Grasa de alto vacío Danieau's |
| Dow | Corning | DCC000001242 150 g | Grasa de dióxido de silicona |
| KCl 99% | Sigma-Aldrich | S7643-5kg | Para preparar 30x Danieau's |
| MgSO4.7H2O Sulfato de magnesio heptahidratado 98+% Reactivo A.C.S | Sigma-Aldrich | 230291-500g | Para preparar 30x Microinyector Danieau |
| Eppendorf | FemtoJet | ||
| Micromanipulador Eppendorf | 930001007 | 0.5-20 ul | |
| Maerzhaeuser Wetzlar | MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R | ||
| Soporte de micropipeta | Intracel | N/P 50-00XX-130-1 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripción | Ambion | AM1340 | Para transcribir PCS-Transposase |
| NaCl BioXtra >99.5% | Sigma-Aldrich | P9541-1kg | Para preparar 30x |
| Nanofotómetro de Danieau | Para medir la concentración de ADN/ARN | ||
| Tirador de aguja | Sutter Instrument | P-1000 | Flaming/Brown |
| NIR Apo 40x/0.80W | Objetivo de cono de inmersión en agua | Nikon | |
| N-Feniltiourea Grado I, aprox. 98% | Sigma | P7629-10G | PTU (previene la pigmentación) |
| Placas de Petri | Sarstedt AG | 821472 | 92 x 16 mm |
| Moldes de plástico | Herramientas de ciencia adaptativa | TU-1 | Para microinyecciones |
| Cubierta de plexiglás con un agujero | Hecho | a medida El agujero de la cubierta de plexiglás debe ser 3 mm más grande que el diámetro del objetivo del cono de inmersión en agua | |
| Colador de té (plástico) | Para recoger huevos de pez cebra | ||
| Controlador de temperatura | Warner Instrument Corporation | TC-344B | Temperatura automática dual |
| Controlador Pipetas de transferencia | Sarstedt AG | 86.1171 | Pipetas de transferencia de plástico de 3,5 ml |
| UMPlanFI 100x/1,00 W | Olympus | Objetivo de cono de inmersión | |
| en agua UMPlanFLN 20x/0,50 W; | Olympus | Objetivo de cono de inmersión | |
| en agua Microscopio de campo amplio | Olympus | BX51WI | |
| PTU (50x Stock) | Disolver 76 mg de PTU en 50 ml de agua destilada Remover vigorosamente a temperatura ambiente Almacenar a -20 oC en 1 ml alícuotas Usar en 1x solución de trabajo | ||
| Tricaína (20x Stock) | Disolver 200 mg de Tricaína en 48 ml de agua destilada Añadir 2 ml 1M Tris base (pH9) Ajustar al pH 7 Almacenar a -20 oC en 1 ml alícuotas Usar en 1x solución | ||
| de trabajo Solución de Danieau (30x stock) | 1.740 mM NaCl 21 mM KCl 12 mM MgSO4.7H2O 18 mM Ca (NO3)2 150 mM Búfer HEPES Agua destilada hasta 1 L Tienda a 4 oC Úselo en una solución de trabajo de 0.3x |
Referencias
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W.
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Reimpresiones y permisos
