Se eligió el cultivo tridimensional en perlas de alginato, debido a su simplicidad y reproducibilidad, para mantener las células de adenoma hipofisario. Los procedimientos incluyeron una digestión enzimática inicial y disociación mecánica del tejido tumoral, y la posterior suspensión celular se encapsuló en perlas de alginato.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Tridimensional de alginato-grano Cultura de células humanas del adenoma pituitario
En este artículo
Resumen
Resumen
Se describe un método de cultivo en tres dimensiones en el que las células de adenoma de la pituitaria primaria se cultivan en perlas de alginato. El alginato es un polímero derivado de algas pardas marinas. Brevemente, el tejido tumoral se corta en trozos pequeños y se sometió a una digestión enzimática con colagenasa y tripsina. A continuación, se obtiene una suspensión de células. La suspensión de células tumorales se mezcla con alginato de sodio 1,2% y se dejó caer en una solución de CaCl 2, y la suspensión de alginato / célula se gelifica al contacto con el CaCl 2 para formar perlas esféricas. Las células incrustadas en las perlas de alginato se suministran con nutrientes proporcionados por los medios de cultivo enriquecidos con 20% de FBS. cultivo tridimensional en perlas de alginato mantiene la viabilidad de las células de adenoma durante largos períodos de tiempo, hasta cuatro meses. Por otra parte, las células pueden ser liberados del alginato por lavado de las perlas con citrato de sodio y se sembraron en cubreobjetos de vidrio para análisis adicionales inmunocitoquímicos. El uso de un celmodelo l de cultivo permite la fijación y la visualización del citoesqueleto de actina con la desorganización mínima. En resumen, perlas de alginato proporcionan un sistema de cultivo fiable para el mantenimiento de las células adenoma hipofisario.
Introducción
Andamios tridimensionales se han utilizado ampliamente en el cultivo de células, ya que proporcionan un soporte estructural tridimensional para células cultivadas y el mantenimiento de la comunicación de célula a célula 1. materiales de polímero de origen natural se han utilizado para hacer los andamios tridimensionales incluyendo colágeno de tipo I, quitosano y alginato. El alginato es un polímero natural derivado de la Macrocystispyrifera algas de mar marrón (Kelp). Este polímero se compone de unidades repetidas de ácido β-D-manurónico (M) y α-L-gulurónico ácido (G) 2 y forma geles estables en presencia de ciertos cationes divalentes,....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Este estudio fue aprobado por el uso de material humano por los comités éticos locales de la institución médica y el Centro de Investigación y Estudios con antelación por el Instituto Politécnico Nacional.
1. Tumor Obtención de Muestras
- Obtener la biopsia de tejido del adenoma pituitario de un paciente a través de un procedimiento quirúrgico trans-esfenoidal 14.
- Recoger la muestra pituitaria adenoma y colocarlo en una botella de vidrio estéril que contiene 50 ml de fresco 199 medio de cultivo (M199) enriquecido con 10% de suero bovino fetal (FBS), 0,6 mg / bicarbonato de sodio ml, 2,4 mg / ml HEPES y 1% ant....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Este protocolo se ha aplicado con éxito en el cultivo y mantenimiento de las células del adenoma pituitario en perlas de alginato para diferentes períodos de tiempo La figura 1 muestra células embebidas en perlas de alginato al cabo de tres meses.; estas células presentan formas redondeadas bi-refracción bajo un microscopio de luz invertida (Figura 1). Figura 2 muestra la localización de N-cadherina en células de adenoma de pituitaria de.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo tiene varios pasos críticos. La primera es la homogeneidad del tamaño del grano, que se requiere para mantener las mismas condiciones de difusión de los nutrientes y gases en todo el cultivo de células. En nuestra experiencia, el uso de una aguja de 21 G para hacer las perlas de alginato permite la adquisición de una cultura eficiente de tamaño uniforme de talón. El segundo factor importante es la distancia desde la aguja; esta distancia debe ser no más de 5 cm de la solución de calcio para evitar perlas .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Sr. O. Ríos por su asistencia técnica.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 199 medio de cultivo | Invitrogen | 31100-027 | Para la cultura, cálido en un 37 ° C baño de agua antes de usar |
| Suero fetal bovino | PAA | A15-751 | |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-hidroxietil) piperazina-N&agudo;-ácido -2etanosulfónico (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicilina/Estreptomicina | PAA | P11-010 | |
| PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Colagenasa tipo I | Worthington | 4176 | |
| Tripsina | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Research Organics | 3002E Inhibidor | |
| tripsina de sorbea | Invitrogen | 17075-029 | |
| ADNasa | Worthington | 2139 | |
| Ácido algínico, de Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Cloruro de calcio (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Citrato de sodio (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazina-N,N′-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polietilenglicol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Etileno ácido tetraacético glicol (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehído | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | |
| Cloruro de amonio (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Albúmina sérica bovina libre de IgG | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Faloidina – Tetrametilrodamina B isotiocianato | Sigma | P1951 | tóxico. Use guantes para manipular este reactivo |
| 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidrocloruro (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Tóxico. Use guantes para manipular este reactivo |
| Ácido sulfúrico (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Altamente corrosivo. Use guantes para manipular este reactivo |
| Hidróxido de sodio (NAOH) | Merck | 1.06498 | Puede causar irritación de los ojos y la piel. Use guantes para manipular este reactivo |
| (3-aminopropil)trietoxisilano (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Hidrobromuro de poli-D-lisina | Sigma | P7280 | |
| Solución de azul de tripán | Sigma | T8154 | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Equipment | Tóxico: Puede causar cáncer. Use guantes para manipular este reactivo | ||
| Rotador | Centrífuga Boekel Scientific | Modelo 230300 | |
| DuPont | Corporation | Modelo sorvall TC6 | |
| agitador | Instrumentos de línea de laboratorio | modelo 314-820 |
Referencias
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
