القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
الخيطية أكتين تلعب دورا حاسما في معظم العمليات المحمولة بما في ذلك القدرة على الحركة و، في الخلايا المناعية، وتشكيل التفاعل خلية خلية الرئيسي المعروف باسم المشبك المناعي. وتكهن F-الأكتين أيضا أن تلعب دورا في تنظيم توزيع الجزيئية في غشاء الخلايا بما في ذلك ديناميات الحويصلة شبه غشائي والبروتين المجموعات. في حين تسمح تقنيات المجهر الضوئي القياسية الملاحظات المعممة ومحدودة الحيود أن يكون جعلت، العديد من الأحداث الخلوية والجزيئية بما في ذلك تجميع وتدفق الجزيئي تحدث في السكان في طول المقاييس أقل بكثير من حل السلطة من المجهر الضوئي العادي. من خلال الجمع بين مجموع مضان انعكاس داخلي مع سوبر القرار التصوير أسلوب منظم إضاءة المجهر، وسجلت تدفق الجزيئية ثنائي الأبعاد من F-الأكتين في المشبك المناعي للخلايا T. المكانية والزمانية صورة ارتباط التحليل الطيفي (عصي) تم تطبيق ذلك الحين، مما يولد بالنتيجه قابلة للقياس الكميالخبر في شكل رسوم بيانية وخرائط سرعة ناقل يمثل اتجاهها التدفق والحجم. يصف هذا البروتوكول الجمع بين التصوير وعصي تقنيات فائقة الدقة لتوليد تدفق ناقلات عند مستويات الحيود الفرعي من التفاصيل. وقد استخدمت هذه التقنية لتأكيد تدفق الأكتين التي هي إلى الوراء بشكل متناظر وجابذ في جميع أنحاء محيط الخلايا T على تشكيل المشبك.
Introduction
الهدف من التجربة هو صورة وتميز تدفق الجزيئي للfilamentous- (F-) الأكتين في الخلايا الحية T، خارج حدود الحيود من أجل إقامة اتجاه التدفق والحجم خلال المشبك المناعي (IS) تشكيل. وسيتم تنفيذ هذه التقنية خارج باستخدام مجهر إضاءة منظم (SIM) في مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) واسطة، تصوير Jurkat T-خلايا تشكيل المشبك الاصطناعي على تفعيل coverslips المغلفة مع المضادة للCD3- وأضداد CD28. الأشكال ما بين خلية T وهدفه. مستضد تقديم الخلية (APC) على مستقبلات الخلايا T (TCR) تفعيل 1،2. وبما أن هذه هي الخطوة الأولى في تحديد ما إذا كان جهاز المناعة التكيفية يولد استجابة مناعية للعدوى، فإن الآثار المترتبة على الاستجابة للمؤثرات غير صحيحة يسبب عددا من الأمراض. تم توثيقه على أهمية التفاعل T خلايا APC جيدا، ومع ذلك، فإن دور (ق) من ناضجة بعد الاشتراكية TCR الأولياستيعاب gnal لا يزال يتعين مفهومة تماما.
كما يعتقد أن الهيكل الخلوي للمساعدة بعمليتين مترابطتين إلى تفعيل TCR (حركة جزيئات في غشاء البلازما والتحكم في الجزيئات مما يشير تعتمد على الهيكل الخلوي الأكتين 3،4)، فهم كيفية إعادة ترتيب الهيكل الخلوي مكانيا وزمانيا وتوضيح الخطوات إعادة التنظيم الجزيئي خلال تشكيل المشبك. ويعتقد أن تدفق الوراء من F-الأكتين إلى زريبة مجموعات TCR نحو مركز المشبك المناعي، ويعتقد أن هذا النبات هو أمر حيوي لوقف إشارة وإعادة التدوير؛ مساعدة التوازن الدقيق من تنشيط الخلايا T 5.
في حين المجهر مضان القياسية هو أداة مرنة تواصل تقديم فكرة واسعة عن العديد من الأحداث البيولوجية بما في ذلك التفاعلات خلية خلية، ويقتصر من قبل قدرة النظام على حل بدقة fluorophores متعددة المقيمين أقرب من diffrالحد عمل (≈200 نانومتر) من بعضهما البعض. والعديد من الأحداث الجزيئية داخل الخلايا وتشمل السكان الكثيفة من الجزيئات وتبدي إعادة ترتيب الحيوي سواء في هدوء أو على التحفيز معين، المجهر الضوئي التقليدي لا تقدم الصورة كاملة.
وقد أتاح استخدام القرار التصوير سوبر الباحثين للتحايل على حد الحيود باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات. واحد جزيء توطين المجهري (SMLM) مثل النخيل وSTORM 6،7 لديه القدرة على حل مكان الجزيئات تصل إلى دقة من حوالي 20 نانومتر، ومع ذلك، هذه التقنيات تعتمد على الاستحواذ الأوقات الطويلة، وبناء صورة على العديد من إطارات . عموما هذا يتطلب عينات أن تكون ثابتة أو هياكل لتظهر التنقل منخفضة لا يساء تفسيرها fluorophores واحدة وذلك عدة نقاط. في حين استنزاف الانبعاث المستحث (STED) التصوير يسمح فائقة الدقة من خلال انتقائية جدا متحد البؤر الإثارة 8، والمسح المطلوبةالنهج يمكن أن تكون بطيئة على حقول خلية كاملة للعرض. يوضح STED أيضا الضيائية كبيرة لدقة أعلى وذلك بسبب الزيادة في قوة شعاع استنزاف.
منظم إضاءة المجهر (SIM 9) يوفر بديلا لهذه الأساليب، قادرة على مضاعفة حل المجهر مضان القياسية وأكثر توافقا مع تصوير الخلايا الحية من تقنيات SMLM الحالية. ويستخدم الصلاحيات ليزر أقل، على نظام واسعة المجال لحقول خلية كاملة من الرأي؛ توفير زيادة سرعات الاستحواذ، ومتوافق مع وضع العلامات fluorophore القياسية. طبيعة واسعة المجال لSIM أيضا يسمح للاستخدام من مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) عن الإثارة انتقائية للغاية، مع عمق تغلغل في البعد المحوري <100 نانومتر.
التحليل الطيفي ارتباط صورة (ICS) هو وسيلة لربط التقلبات في كثافة مضان. وتطور ICS. ايم المكانية والزمانيةعمر ارتباط التحليل الطيفي (عصي 10) يرتبط إشارات الفلورية الخلايا في الزمان والمكان. عن طريق الربط بين كثافة بكسل مع توضيح بكسل في الأطر المتخلفة عبر وظيفة الارتباط، وحصلت على معلومات بشأن سرعة تدفق واتجاهها. لضمان الأجسام الساكنة لا تتداخل مع تحليل عصي، يتم تطبيق عامل تصفية كائن متحرك، والذي يعمل عن طريق طرح المتوسط المتحرك لشدة بكسل.
ويعتقد أن تقنية المعروضة هنا لتكون أول مظاهرة من صورة الارتباط الطيفي يجري تطبيقها على البيانات المجهر فائقة الدقة لقياس تدفق الجزيئات في الخلايا الحية 11. يحسن هذا الأسلوب على التصوير محدودة حيود تدفق F-الأكتين عن طريق تحليل عصي 12، وسوف تتناسب مع الباحثين الذين يرغبون في تحديد التدفق الجزيئي ثنائي الأبعاد في الخلايا الحية، من البيانات التي حصل عليها في القرارات المكانية تتجاوز الحد حيود الضوء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهذه التقنية تسمح للباحثين لصورة وكميا في السابق ان التفاصيل غير القابلة للحل في الخلايا معربا عن مضان. في نتائجنا، وتبين أن F-الأكتين تدفقات بطريقة متناظرة من محيط الخلية نحو مركز الخلية في الخلية T IS. هذه النتائج تتفق مع نتائج سابقة من خط 1D البيانات الشخصية ل مخطاط ا?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
Referencias
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
