Los cultivos de baja densidad de neuronas primarias del hipocampo generalmente requieren una capa alimentadora de glía para suministrar factores neurotróficos y mantener la longevidad. Describimos aquí un método simplificado para cultivar neuronas de ultra baja densidad en cubreobjetos de vidrio en presencia de una capa alimentadora de neuronas de alta densidad, lo que facilita la investigación de mecanismos neuronal-autónomos específicos.
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Artículo de método
Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura
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Resumen
Resumen
El cultivo de neuronas del hipocampo primaria in vitro facilita el interrogatorio mecanicista de muchos aspectos del desarrollo neuronal. Disociadas las neuronas del hipocampo embrionarias a menudo pueden crecer con éxito en cubreobjetos de vidrio a alta densidad en condiciones libres de suero, pero los cultivos de baja densidad normalmente requieren un suministro de factores tróficos por ellos co-cultivo con una capa de alimentación glia, la preparación de los cuales puede llevar mucho tiempo y laborioso. Además, la presencia de glia puede confundir la interpretación de los resultados y los estudios se oponen sobre los mecanismos específicos de neuronas. A continuación, se presenta un método simplificado de ultra-baja densidad (~ 2.000 neuronas / cm2), a largo plazo (> 3 meses) la cultura de las neuronas del hipocampo primaria que se encuentra bajo condiciones libres de suero y sin apoyo de células glia. neuronas de baja densidad se cultivan en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina, y se volcó en las neuronas cultivadas de alta densidad en una placa de 24 pocillos. En lugar de utilizar puntos de parafina para crear un espacio between las dos capas neuronales, los experimentadores pueden simplemente grabar el fondo de plástico del pozo, en el que residen las neuronas de alta densidad, para crear un microespacio propicio para el crecimiento de las neuronas de baja densidad. El co-cultivo puede ser mantenido fácilmente durante> 3 meses sin pérdida significativa de neuronas de baja densidad, lo que facilita el estudio morfológico y fisiológico de estas neuronas. Para ilustrar esta condición de cultivo exitoso, se proporcionan los datos para mostrar la formación de sinapsis profusa en las células de baja densidad después del cultivo prolongado. Este sistema de co-cultivo facilita también la supervivencia de las neuronas individuales dispersas cultivadas en islas de sustratos de poli-D-lisina y por lo tanto la formación de conexiones autaptic.
Introducción
Cultivo de neuronas del hipocampo en condiciones in vitro permite la observación y la manipulación experimental de estas neuronas que de otra manera no son posibles en vivo. Este enfoque experimental es ampliamente utilizado para revelar los mecanismos neuronales de crecimiento, la polaridad, la especificación de neuritas, el tráfico y la localización subcelular de las proteínas, la formación de sinapsis y la maduración funcional 1. Estos in vitro neuronas del hipocampo en cultivo, cuando se cosecha a partir de las últimas etapas embrionarias, son relativamente puro (> 90%) de las células glutamatérgicas de la morfología piramida....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arizona, y se ajustaban a las directrices del NIH.
1. El tejido del hipocampo Fuente de Neurona Cultura
- Para generar crías prenatales de ratón para el cultivo de neuronas del hipocampo, utilizar ratones en tiempo de embarazo (C57Bl6 / J) que se crían en la casa 17. Al día con la detección del tapón vaginal se designa como E0.5. El tiempo de la cosecha prevista para la cultura es E16.5-E17.5.
Nota: Este protocolo describe las culturas de dos placas de 24 pocillos de ....
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Resultados
El protocolo descrito aquí permite éxito densidad ultra-baja, cultivo a largo plazo de las neuronas glutamatérgicas puro sin la necesidad de células de la glia que actúa como una capa de alimentación. El protocolo se esquematiza en la Figura 1, que implica la preparación de alta densidad (en poli-D-lisina recubierto de 24 pocillos) y las neuronas de baja densidad (en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-D-lisina) por separado, y la posterior co-cultivo que puede m.......
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Discusión
Se presenta un protocolo detallado para el cultivo a largo plazo de ultra baja densidad de neuronas glutamatérgicas del hipocampo en condiciones libres de suero. En 2000 ~ neuronas / cm2, la densidad es al menos dos veces menor que la mayoría de los preparativos de baja densidad 'de cultivo con o sin el apoyo glía reportado por la literatura existente 2,3,11,13,14. Además de ser ultra-baja densidad, este protocolo es nueva y significativa en dos formas más. En primer lugar, no se necesita ningu.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por una subvención de los NIH/NIMH a S.Q. (R00MH087628).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | Proteger de la luz |
| B27 suplemento | Life Technologies | 17504-044 | alícuota, conservar en tamaño de 0,6ml |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | diluido 100X |
| antibiótico-antimicótico (AA) | Life Technologies | 15240-096 | diluido 100X |
| Medio de cultivo | Medio neurobasal con 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Medio de lavado | igual que 'Medio neurobasal'Medio | ||
| alimentación | Neurobasal con 1X B27 suplemento | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock a 0,6 mg/ml |
| poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| tampón de borato | Sigma-Aldrich | B6768 (ácido bórico); 71997 (bórax) | 1,24 g de ácido bórico y 1,9 g de bórax en 400 ml de H2O, pH a 8,5 uso HCl |
| Cubreobjetos de vidrio redondos de 12 mm | Cristaleríanfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | Nº 1 vidrio, compra de Carolina Biological Supply |
| kit de transfección Promega | E1200 | ver protocolo para más detalles | |
| 2X solución salina tamponada HEPES (HBS) | Promega | E1200 | ver protocolo para más detalles |
| Filtro de jeringa | Pall Corporation | 4192 | 0.2um tamaño de poro |
| Kit de preparación de plásmidos Endofree | Qiagen | 12362 | para la preparación de ADN plásmido de grado de transfección |
| anticuerpo anti-MAP2 | Millipore | MAB3418 | anticuerpo de ratón, clon AP20 |
| anticuerpo anti-p-Tau | Millipore | AB10417 | conejo anticuerpo policlonal |
| anticuerpo anti-NR1 | Millipore | MAB1586 anticuerpo de ratón, clon R1JHL | |
| anticuerpo anti-GluR1 | Millipore | AB1504 | conejo anticuerpo policlonal |
| solución salina equilibrada de Hank's | ThermoFisher 14025092 | tamaño 500ml |
Referencias
- Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G.
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Reimpresiones y permisos
