אנו מתארים המבדק פשוט מבוססי תאים לזיהוי, כימות לפקח על פעילות בני משפחת פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם של הליגנדים. את assay משתמש קולטנים chimeric לידי ביטוי קו תא גורם תלוי לתת הערכה וכמותיות או הכמות של קולטן מחייב cross-linking ידי ליגנד.
הניתוח של טירוזין קינאז הקולטן הליגנדים האינטראקציה שלהם מעורב ביולוגיה וסקולרית הרבה פעמים הוא מאתגר בשל הביטוי המכונן של משפחות של רצפטורים קשורים, מגוון רחב של הליגנדים המתייחסים ואת הקושי להתמודד עם תרבויות עיקריות של תאי אנדותל מיוחדים. כאן אנו מתארים מבדק לצורך זיהוי של הליגנדים לגורם צמיחה של אנדותל כלי דם קולטן 2 (VEGFR-2), מתמר מפתח של אותות המקדמים אנגיוגנזה lymphangiogenesis. CDNA קידוד היתוך של האזור (ליגנד המחייבת) תאיים של VEGFR-2 עם הטרנסממברני ואזורי cytoplasmic של הקולטן אריתרופואטין (EpoR) מתבטא הקו הסלולרי גורם תלויה Ba / F3. שורת תאים זה גדל בנוכחות interleukin-3 (IL-3) ונסיגה של תוצאות גורם זה מוות של תאים בתוך 24 שעות. הביטוי של היתוך קולטן VEGFR-2 / EpoR מספק מנגנון חלופי לקדם הישרדות בפוטנציהlly תרבות תאי Ba / F3 transfected ביציבות בנוכחות ליגנד מסוגל חייב cross-linking החלק התאי של חלבון ההיתוך (כלומר, אחד שיכול קשר צולב באזור תאיים VEGFR-2). Assay יכול להתבצע בשתי דרכים: גישה כמותית למחצה שבו כמויות קטנות של ליגנד ותאי להתיר מכך מהיר ב -24 שעות, ועל גישת כמותית המעורבת סמנים פונדקאיים של מספר תאי קיימא. Assay הוא יחסית קל לבצע, הוא היענות נלהבת הליגנדים VEGFR-2 ידוע והוא יכול להכיל מעכבי תאיים של VEGFR-2 איתות כגון נוגדנים חד שבטיים לקולטן או ליגנדים, ומלכודות ליגנד מסיסים.
הגורם (vascular endothelial growth VEGF) המשפחה של גורמי גדילה חלבון המופרש ו קולטנים בתא השטח מאותו מקור שלהם היא קבוצה חשובה ומגוונת של הליגנדים מסיסים קולטני-מוטבע הממברנה, בהתאמה כי הפונקציה transducing אותות על פני קרום התא. הן מתפקדות בעיקר בתאי האנדותל אלא גם בתאים ממוצא אפיתל ואלה של 1,2 מערכת החיסון. מסלולי איתות עוסקת ידי קולטני VEGF המופעל ליגנד (VEGFRs) הן קריטיות פתולוגיות הגדולות, כגון ניוון וסרטן מקולרי הקשור לגיל, ותרופות מיקוד מהם נמצאים בשימוש קליני תכופים (למשל, bevacizumab נוגדן חד-שבטי שמכוונת-A VEGF) 3,4.
אחת המורכבויות של משפחת VEGF הוא המגוון של הליגנדים מסיסים הנוכחי בטבע (-A VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, חלבונים VEGF המקודדים על ידי ORF המשפחה וירוס parapox ו VEGF ארס נחשים, בתוספת אחרים מעכבisoforms של VEGF-A) 2.
ליגנדים אלה אינטראקציה עם שלושה מבני משפחת טירוזין קינאז קולטן, כלומר VEGFR-1, VEGFR-2 ו VEGFR-3. קולטנים אלה באים לידי ביטוי variably על תאים מסוגים שונים, אך לעתים קרובות הם הביעו במשותף על פני השטח של תאי האנדותל המרפדים את כלי הדם הלימפה מכל הגדלים 5. VEGFR-2 יכול לחייב את יונקים הליגנדים VEGF-A 6, VEGF-C 7 ו VEGF-D 8,9 וכן ORF וירוס 10 VEGF ו- נחש ארס 11 VEGF. VEGFR-2 משחק תפקיד מרכזי בהנעת אנגיוגנזה (צמיחת כלי דם חדשים מכלי קיימים) ב ההתפתחות העוברית, ריפוי פצעים, סרטן ומחלות עיניים. בהקשרים אלה, הליגנדים כגון-A VEGF, לאגד -C ו -D ולהפעיל את הקולטן על תאי האנדותל של כלי דם דם 12-15. על תאי אנדותל הלימפה, VEGFR-2 ממלא תפקיד lymphangiogenesis, היווצרות של כלי הלימפה חדש 16. VEGFR-2 יכול גם לקדם התרחבות והרחבת העורקים הגדולים lymphatics בתאים בריאים המחלה 17. הבנה מלאה של VEGFR-2: אינטראקציות ליגנד לכן חשובה לפיתוח מעכבים לשימוש בטיפול במחלות תלויה אנגיוגנזה 18. בעוד שרוב isoforms של VEGF-A נקשר VEGFR-2, מחשוף פרוטאוליטים של VEGF-C ו- VEGF-D נדרש לשחרר שבר המורכב של תחום VEGF-ההומולוגיה שמספק זיקה גבוהה מחייבת VEGFR-2 19,20.
פתחנו מבדק לפקח ליגנדים של VEGFR-2 אשר נועד לעקוף את הצורך בתאי האנדותל עיקריים, אשר קשים מבחינה טכנית למעבר, יקרים לרכישת תרבות (הדורשים בינוני מיוחד) 21 ולהביע VEGFRs מרובה הקשורים שיתוף קולטני 22. Heterodimerization של VEGFR-2 עם קולטנים VEGF אחרים או-קולטנים שיתוף יכול לגרום מורכבות רצויות כאשר מכוון כדי הרבעהקולטן ליגנד אינטראקציות בינארי y, הערכת פעילות מיוחסת קולטן מסוים, או בהערכת ההשפעה של חומרים כימיים מעכבות. 23. המבדק שומר ניידות של הקולטן הרלוונטי בקרום התא ומאפשר הערכה של יכולתו של ליגנד לקשור קשר צולב באזור תאיים VEGFR-2.
המבדק מסתמך על יצירת קולטן chimeric בו נמצא האזור תאיים של קולטן VEGF (במקרה זה VEGFR-2) הוא קיבע את הטרנסממברני ואזורים תאיים של קולטן אריתרופואטין (EpoR), חבר של המשפחה הקולטן ציטוקינים 8,24. חלבון היתוך זו בא לידי ביטוי אז הקו הסלולרי פרו-B תלוי הגורם Ba / F3, שעליו גירוי עם ליגנד מסוגל מחייב צולבות המקשרים את התחום התאי של הקולטן גורם הפעלה של האזור מפעיל cytoplasmic, מסוגל של transducing אות הישרדות באמצעות קינאזות יאנוס (JAKs) לקדם התאהישרדות ו / או התפשטות. לעומת זאת, הביטוי של VEGFR-2 באורך מלא בסוג התא אותו, וגירוי עם ליגנד, אינו מקדם הישרדות התא ושגשוגם, המציין כי effectors איתות הפרוקסימלי של מסלול VEGFR-2 אינם זמינים סוג תא זה.
השתמשנו assay במגוון בהקשרים לחקור מחייב של הליגנדים VEGFR-2 הרומן 10,19,20,24-29. בשילוב עם assay VEGFR-3-EpoR-Ba / F3, השווינו את הפעילות היחסית של VEGF-C ו- גורמי גדילה VEGF-D לקשירה cross-linking VEGFR-2 ו VEGFR-3 30. את assay נעשה שימוש כדי לאפיין את פעילות המעכבת של נוגדנים מנטרלים חד-שבטיים כדי VEGFR-2 או VEGF-D, מלכודת VEGFR-2 מסיסים peptidomimetics מיקוד המשפחה VEGF 31. את assay שימש גם להראות את היכולת של VEGFs מן זני נגיף ORF שונים לקשור קשר צולב VEGFR-2 לפני הבדיקה בתאי האנדותל העיקרי <sעד> 10,26. Assay הוא שימושי במיוחד עבור לסינון המהיר של מוטציות של VEGFs אשר ניתן להעריך במהירות לפעילות לפני שהם מוצגים בפני מבחני תא האנדותל המייגעים יותר 25 או כאשר פרוטוקולי הערכה לצמיחת טיהור גורמי 27.
את assay אנו מתארים הוא קל לביצוע, והגרסה וכמותיות מאפשרת לקביעות מהירה שלפעמים נדרשות כאשר הניטור בייצור או הטיהור של גורמי גדילה, נוגדנים או תחומי קולטן מסיסים לניסויים אחרים. קלות השימוש של assay עושות את זה אידיאלי המשלים עוד ועוד מחקרים מלאים הופיעו עם תאי אנדותל עיקריים נגזרו דם או כלי לימפה מרקמות ספציפיות או מערכות איברים.
Assay המתואר כאן מסתמך על שימוש בתאים של כדאיויות גבוהות, אשר תלויים בגורמי צמיחה. תאים ולכן צריכים להיות מתורבת בקפידה כדי לוודא שהם גורמים תלויים, ולשמר ביטוי של הקולטן chimeric. הבטיח כי המדיום הוא עשה טרי ולא מאוחסן לתקופת זמן ממושכת מדי וכי אחד מעמיתי המחקר-3D CM הוא מאוד …
The authors have nothing to disclose.
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |