Se describe un bioensayo sencillo basado en células para la detección, cuantificación y seguimiento de la actividad de los miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular de ligandos. El ensayo utiliza receptores quiméricos expresados en una línea celular dependiente de factor para proporcionar una evaluación semi-cuantitativa o cuantitativa de la unión al receptor y la reticulación por el ligando.
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Artículo de método
Un ensayo biológico simple para la Evaluación de Factores de Crecimiento Endotelial Vascular
En este artículo
Resumen
Resumen
El análisis de receptores tirosina quinasas y sus ligandos que interactúan implicadas en la biología vascular es a menudo difícil debido a la expresión constitutiva de familias de receptores relacionados, una amplia gama de ligandos relacionados, y la dificultad de tratar con cultivos primarios de células endoteliales especializadas. Aquí se describe un bioensayo para la detección de ligandos para el factor de crecimiento vascular endotelial receptor-2 (VEGFR-2), un transductor clave de las señales que promueven la angiogénesis y linfangiogénesis. Un ADNc que codifica una fusión de la región extracelular (de unión a ligando) de VEGFR-2 con la transmembrana y las regiones citoplásmicas del receptor de la eritropoyetina (EpoR) se expresa en la línea celular dependiente del factor de Ba / F3. Esta línea celular crece en presencia de interleucina-3 (IL-3) y la retirada de este factor de resultados en la muerte de las células dentro de 24 hr. La expresión de la / EpoR fusión del receptor VEGFR-2 proporciona un mecanismo alternativo para promover la supervivencia y potentiala proliferación de las células LLY Ba / F3 transfectadas de forma estable en presencia de un ligando capaz de unirse y reticulación de la porción extracelular de la proteína de fusión (es decir, uno que puede reticular la región extracelular de VEGFR-2). El ensayo se puede realizar de dos formas: un enfoque semi-cuantitativa en la que pequeños volúmenes de ligando y células permiten un resultado rápido en 24 horas, y un enfoque cuantitativo que implica marcadores sustitutos de un número de células viables. El ensayo es relativamente fácil de realizar, es muy sensible a conocidos VEGFR-2 ligandos y puede acomodar inhibidores extracelulares de VEGFR-2 de señalización tales como anticuerpos monoclonales para el receptor o ligandos, y las trampas de ligando soluble.
Introducción
La familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de factores de crecimiento proteína secretada y sus receptores de la superficie celular afines es un grupo importante y diverso de ligandos solubles y los receptores de membrana embebido en, respectivamente, que la función en la transducción de señales a través de las membranas celulares. Funcionan principalmente en las células endoteliales sino también en las células de origen epitelial y las del sistema inmune 1,2. Vías de señalización contratados por los receptores activados por ligando VEGF (VEGFRs) son críticos en las principales patologías, como la degeneración y el cáncer macular relaci....
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Protocolo
Medium fuente de IL-3 y Preparación de WEHI-3D acondicionado
Nota: La línea celular de leucemia mieloide de ratón WEHI-3D se cultiva para generar un medio acondicionado que contenía IL-3.
- Cultura WEHI-3D en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM), suero bovino fetal al 10% (FBS), 1% de suplemento de glutamina-vida larga, 50 mg / ml de gentamicina. Inocular 5 × 10 6 células en la fase logarítmica de crecimiento en 50 ml de medio de cultivo fresco en una T175 cm matraz de cultivo de 3 tejidos y crecer durante aproximadamente 7 días o hasta que las células han pasado su fase logarítmica de crecimiento....
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Resultados
En esta sección, se muestran los resultados de un experimento que demuestra las características esenciales de un bioensayo VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (véase la Figura 1 para principios del ensayo). Otros estudios publicados demuestran aplicaciones más amplias del ensayo para alternativas VEGFR-2 ligandos, moléculas de VEGF mutantes y los anticuerpos monoclonales inhibidores 8,10,19,24-30.
Los datos presen.......
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Discusión
El ensayo descrito aquí se basa en el uso de células de alta viabilidad, que son dependientes de factores de crecimiento. Por lo tanto, las células tienen que ser cuidadosamente cultivadas para asegurar que son dependiente del factor, y conservan la expresión del receptor quimérico. Asegurar que el medio está recién hecha y no se almacena por un período excesivamente largo y que WEHI-CM 3D es altamente activo es importante. Las células necesitan ser lavados a fondo de IL-3 que contiene el medio en el medio de ensayo par.......
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Divulgaciones
Steven A. Stacker y Marc M. Achen son accionistas de circadiano Technologies Ltd., una compañía de desarrollo de terapias apuntando a la familia VEGF de factores de crecimiento.
Agradecimientos
SAS y MGA cuentan con el apoyo de Subvenciones de Proyectos, una Subvención de Programa y Becas de Investigación del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia (NHMRC), y por fondos del Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa proporcionado por el Gobierno de Victoria, Australia. MMH cuenta con el apoyo de una beca de la Fundación Peter MacCallum.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Trypan | Blue Sigma-Aldrich | T8154 | en PBS se utiliza 1:1 con suspensiones celulares para medir células viables. Peligro: puede causar cáncer |
| G418 Sulfato (Geneticina) | Invivogen | ant-gn-5 | Agente para seleccionar células eucariotas transfectadas. Peligro: puede causar síntomas de alergia o asma o dificultades respiratorias. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | Este nucleósido radiactivo se incorpora al ADN cromosómico durante la mitosis. Radiación de peligro |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Detección bioluminiscente de ATP celular para cuantificar la viabilidad, utilizando el reactivo de monitorización de ATP |
| Prestoblue Reactivo de viabilidad celular | Invitrogen | A13261 | Indicador de viabilidad celular basado en resazurina. Se vuelve de color rojo en el entorno reductor de la célula |
| Nunc Minibandeja con Nunclon Delta Surface (72 pocillos) | Thermo Scientific | 136528 | Placa de microtitulación pequeña |
| Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos | Falcon, Corning Inc. | ||
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Suero Fetal Bovino | Gibco | 10099-141 | |
| Cosechadora de células | Tomtec Life Sciences | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cosechadora de células | |
| Contador de centelleo líquido | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Contador de centelleo |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | blanco Microplaca Barex de 96 pocillos con filtro GF/Bde 1 y micro; m tamaño de poro |
| Gentamicina | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22 mmm poro de celulosa acetato unidad de filtro de tubo de centrífuga | Costar, Corning Inc. | Los | filtros de tubo de centrífuga 8160 tienen un 0.22 µ m unidad de filtro que contiene membrana CA de poros dentro de un 500 µ Tubo de microcentrífuga de polipropileno de capacidad L. |
| Lector de fluorescencia | BioTek | BioTek Synergy 4 Lector híbrido de microplacas |
Referencias
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (20....
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