Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
A pesar de los avances en la comprensión de la cabeza y el cuello carcinomas de células escamosas (HNSCC) la progresión, la tasa de supervivencia de cinco años sigue siendo baja debido a la recurrencia local y metástasis a distancia. Una hipótesis para explicar esta recurrencia es la presencia de células madre, como el cáncer (CSC) que presentan la quimio y la radio inherente resistencia. Con el fin de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, es necesario disponer de modelos experimentales que validan la eficacia de los tratamientos específicos y, por tanto, disponer de métodos fiables para la identificación y aislamiento de células madre cancerosas. Con este fin, se presenta un protocolo para el aislamiento de células madre cancerosas de las líneas celulares HNSCC humanos que se basa en la combinación de dos granulometrías sucesivas de células realizadas por células activadas por fluorescencia (FACS). El primero de ellos se basa en la propiedad de los CAC a sobreexpresan ATP vinculante cassette (ABC) transportador de proteínas y por lo tanto excluye, entre otros, los tintes de ADN vitales tales como Hoechst 33342. Las células clasificadas con THSe método se identifica como una "población lado" (SP). A medida que las células SP representan un porcentaje bajo (<5%) de las células parentales, es necesario una fase de crecimiento con el fin de aumentar su número antes de la segunda clasificación de células. El siguiente paso permite la selección de células que poseen otras dos características de células madre HNSCC, es decir, alto nivel de expresión del marcador de superficie celular CD44 (CD44 alta) y la sobreexpresión de aldehído deshidrogenasa (ALDH alto). Dado que el uso de un único marcador tiene numerosas limitaciones y dificultades para el aislamiento de células madre cancerosas, la combinación de SP, CD44 y marcadores ALDH proporcionarán una herramienta útil para aislar células madre cancerosas para más ensayos analíticos y funcionales que requieren células viables. Las características madre-como de los CAC fue finalmente validadas in vitro mediante la formación de tumorispheres y la expresión de β-catenina.
Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) es una enfermedad común en todo el mundo ya pesar de los avances en los tratamientos actuales, los pacientes con enfermedad avanzada tienen un mal pronóstico. La tasa de supervivencia 5 años general del paciente es de alrededor de 30% a pesar de la combinación de enfoques terapéuticos que incluyen la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia-terapias dirigidas. Estudios recientes atribuyen recurrencia local y metástasis a distancia para la supervivencia de las células madre, como el cáncer (CSC) siguiendo las terapias contra el cáncer 1. Hay evidencia acumulada apoya la existencia de células que presentan propiedades de células madre (capacidades de estado indiferenciado, auto-renovación y la diferenciación, y la actividad telomerasa) en diversos tumores sólidos incluyendo cáncer de mama, cerebro, próstata, pulmón, colon, páncreas, hígado y piel 2- 10. Sin embargo, el origen de los CAC no está claro 11,12. Ellos pueden ser el resultado de la transformación maligna de las células madre normales o 3,13 dedifferenciación de las células tumorales que adquieren características CSC-como 14,15. Por lo tanto, la comprensión de las vías de distintivos relacionados con CSC proporcionará información sobre el diagnóstico y el tratamiento de HNSCC resistente temprano.
Se ha propuesto que los CAC también poseen fenotipos resistentes que evaden la quimioterapia y la radioterapia estándar, lo que resulta en la recaída del tumor en comparación con la mayor parte de las células tumorales 16-19 y se localizan en hipóxica nichos 20. Se han propuesto numerosos factores para explicar estas resistencias de células madre cancerosas, tales como propensión a la inactividad, mejorado de reparación del ADN, hasta reguladas mecanismos de control del ciclo celular, y la eliminación de radicales libres 21. Por otra parte, varias vías moleculares oncogénicas pueden activarse específicamente en los CAC 17. Con el fin de mejorar el conocimiento de los CAC para terapias selectivas, necesitamos métodos fiables para la identificación y aislamiento de células madre cancerosas, debido a la heterogeneidad de los marcadores relacionados con las células madre envarios tipos de cánceres. 22
En CECC, tallo-como las células iniciadoras de tumores han sido aislados de tumores de pacientes primaria clasificar células que expresan diferentes biomarcadores CSC (tales como transportadores de eflujo de fármaco expresión 23, CD44 alta, baja CD24 CD133 alta, c-Met + 10,24 fenotipo, 25, o una alta actividad de ALDH 26) o el cultivo de tumor primario del paciente para formar squamospheres que tienen propiedades CSC. Sin embargo, el número de squamospheres disminuye drásticamente después de dos pasos, dando así un tamaño pequeño de la muestra para una caracterización adicional estudia 27. Por lo tanto, los ensayos in vitro a partir de líneas celulares bien establecidas es una solución más fácil de diseñar experimentos con el fin de mejorar el conocimiento de los CAC.
El objetivo de este artículo es proponer un método para aislar células madre cancerosas a partir de líneas celulares HNSCC utilizando el análisis de citometría de flujo multiparamétrica unand clasificación de células. La expresión de CD44 en correlación con varias propiedades CSC incluyendo la actividad de ALDH, Side Población (SP) fenotipo, la capacidad y la formación de esferoides tumorigenicidad se utilizan para aislar y caracterizar esta subpoblación de células madre cancerosas. CD44, una glicoproteína de superficie celular, está implicada en la adhesión celular y la migración. CD44 se expresa altamente en muchos tumores sólidos los CAC 28, incluso en modelos de cáncer de cabeza y cuello 29-31. Por otra parte, las células CD44 altas pueden generar in vivo un tumor heterogéneo mientras que las células CD44 bajas no pueden 10. El ensayo SP se basa en el potencial diferencial de las células para flujo de salida el colorante Hoechst 22 a través de la familia de casete de unión a ATP (ABC) de proteínas transportadoras sobreexpresados dentro de la membrana CSC. Este ensayo incluye el uso de inhibidores del transportador ABC como verapamilo en muestras de control. Aldehído deshidrogenasa (ALDH) es una enzima intracelular que está implicada en la conversión de retinol a retácido inoic durante la diferenciación de células madre al comienzo 25,26. Las células que presentan actividad muestran el comportamiento de células madre similares a alta ALDH en HNSCC 26 y un número muy limitado de células de alta ALDH son capaces de generar tumores in vivo 26,32.
La combinación de estos marcadores y propiedades se utilizó con éxito por Bertrand e t al. Para estudiar la resistencia in vitro e in vivo de estas células madre cancerosas a la radiación de fotones y 19 de iones de carbono. Sus resultados mostraron claramente que la combinación de varios marcadores de células y las propiedades son más selectivos para los estudios útiles en poblaciones CECC CSC que los enfoques de un solo marcador.
Este protocolo describe un método fiable para el aislamiento con éxito de células madre cancerosas de una línea celular específica que es aplicable a otras líneas celulares HNSCC. Aislado CSC cabeza y cuello son entonces adecuado para la caracterización molecular más in vitro y validación funcional de trasplante en ratones inmunodeficientes 19. Sin embargo, algunas modificaciones pueden ser probados en función de la población lado o los de alta / ALDH altos porcentaje…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
DMEM | Gibco | 61965-026 | |
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |