Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.
resultados de la respuesta inmune de una compleja interacción entre el sistema inmune innato antígeno no específico y el sistema inmune adaptativo antígeno específico. El sistema inmune es un equilibrio constante en el mantenimiento de la tolerancia a la auto-moléculas y reaccionar rápidamente a los patógenos. Las células dendríticas (DC) son potentes células presentadoras de antígenos profesionales que enlazan el sistema inmune innato al sistema inmune adaptativo y equilibrar la respuesta adaptativa entre lo propio y no propio. Dependiendo de las señales de maduración, las células dendríticas inmaduras se pueden estimular selectivamente a diferenciarse en DCs inmunogénicos o tolerogénicas. células dendríticas inmunogénicas proporcionan señales de proliferación de células T específicas de antígeno para la expansión clonal; mientras que las células dendríticas tolerogénicas regulan la tolerancia por la eliminación de células T específica de antígeno o la expansión clonal de las células T reguladoras. Debido a esta propiedad única, las células dendríticas son muy codiciados como agentes terapéuticos para el cáncer y dise autoinmuneASES. Las células dendríticas se pueden cargar con antígenos específicos in vitro y se inyectan en el cuerpo humano para montar una respuesta inmune específica tanto inmunogénica y tolerogénico. Este trabajo presenta un medio para generar in vitro a partir de monocitos, células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (moDCs), tolerogénico y moDCs maduros que difieren en la expresión de marcadores de superficie, la función y fenotipos metabólicos.
DC fue descrita por primera vez por Paul Langerhans (células de Langerhans) a finales del siglo XIX, como la que hace referencia Jolles 1 y caracterizado por Ralph Steinman y Cohn Zanvil en 1973 que los reconoce como células presentadoras de antígenos profesionales 2. DCs se encuentran en la sangre periférica y en la mayoría de los tejidos del cuerpo, especialmente abundante en los tejidos que están expuestos al ambiente externo tales como la piel (presente como células de Langerhans) y en las paredes de la nariz, los pulmones, el estómago y los intestinos que permiten que se encuentran con antígenos extrínsecos. Inmaduros países en desarrollo tienen la capacidad endocítica pero relativamente baja capacidad de estimular células T 3. Inmaduros países en desarrollo expresan diferentes receptores de reconocimiento de patrones (RRP) que los patrones de captura asociados a patógenos moleculares (PAMPs) o patrones moleculares asociados a daños (apaga) 4. La activación de las señales de peligro en coche hacia la maduración de las CD inmunogénicas mientras auto-moléculas dan lugar a células T unresponsiveness y la apoptosis 5. DCs inmunogénicas se caracterizan por la regulación positiva de moléculas de MHC y moléculas de superficie coestimuladoras y su capacidad de las células T vírgenes 6,7.
Inmaduros países en desarrollo también puede ser madurado hacia un estado Treg-inducir o tolerogénico en respuesta a la vitamina D3 metabolito 1a, 25 (O) 2 D 3 y ciertos agentes inmunosupresores como la interleucina-10 (IL-10), dexametasona y rapamicina 8-9. DCs tolerogénico se caracterizan por su expresión de los motivos de inhibición basado en tirosina inmunoreceptor (ITIM) que contienen receptores de la superficie y ligandos. La transducción de señales de ITIMs que contienen miembros de la familia ILT, ILT3 y ILT4 en los DC tolerogénicos inhibir alloproliferation y conducir Foxp3 + Treg expansión 10,11. Estas propiedades únicas de los DC tolerogénicos conducen a su profunda potencia in vivo, es decir, la capacidad de inducir tolerancia a los injertos alogénicos durable trasplantados y SupprESS el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Tolerogénico DCs se puede ver, por tanto, como un subtipo de DCs maduras polarizada que funcionan de la inhibición de la activación inmune.
Actualmente, hay dos subconjuntos generales de las células dendríticas en la sangre periférica humana: DCs plasmacitoides y CD mieloides 12. DCs circulantes son constituyente rara a menos del 2% de los leucocitos en la sangre humana, y esto supone una dificultad para el aislamiento de un número apropiado de los DC para estudiar sus funciones inmunorreguladoras. Para superar este problema, los monocitos diferenciados DCs se utilizan como un modelo in vitro para el estudio de la función de células dendríticas. Estos países en desarrollo in vitro tienen receptores y funciones similares con respecto a los DC in vivo. Comparación detallada de los DC de vivo, y es los países en desarrollo derivadas de monocitos in vitro (generada moDCs) son investigados por otros laboratorios 13, 14, 15. También se informa de que los moDCs y CD1c + DC fueron equivalentes a presentadora de antígeno y la inducción de la función de las células T 15.
En este trabajo se describe un método para generar moDCs inmaduras a partir de monocitos de sangre periférica y luego diferenciándolos a CD inmunogénicas y tolerogénicas. Estas células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs) se caracterizan por sus marcadores de superficie, perfil de citocinas, funciones inmunorreguladoras y estados metabólicos. células dendríticas inmunogénicas y tolerogénicas producen diferentes citoquinas que dan lugar a la expansión de cualquiera de las células T alogénicas o células T reguladoras. En este trabajo, el perfil de citoquinas se realiza con los sistemas que utilizan la tecnología de multiplexación. El medio de crecimiento de las células se incuban con perlas codificadas por colores anticuerpo inmovilizado y leer en un analizador compacto. estados metabólicos de los países en desarrollo se analizan utilizando analizadores de flujo extracelulares que miden la tasa de consumo de oxígeno, un indicador de la respiración celular, y la tasa de acidificación extracelular que refleja glicolíticaflujo en células dendríticas. La medición de estas tasas de bioenergética proporciona un medio para realizar un seguimiento de los cambios en el metabolismo celular que son vitales en el desarrollo de células dendríticas y la función.
En este trabajo se describe un método para generar a partir de monocitos inmaduras, moDCs moDCs tolerogénicas y moDCs maduros. Los pasos importantes en este protocolo se discuten en detalle en los siguientes párrafos. Es importante tener en cuenta que la sangre periférica humana se utiliza como material de partida en este protocolo y precauciones universales para el manejo de la sangre humana se debe practicar. Aunque es técnicamente factible para derivar DCs de la médula ósea en los seres humanos 24, la diferenciación in vitro de DC células que se encuentran en la sangre periférica se prefiere debido a la disponibilidad de la sangre periférica en comparación con la médula ósea. Entre las células que se encuentran en la sangre periférica, las células y los monocitos CD34 + madre hematopoyéticas se utilizan comúnmente para la generación in vitro de las DC. CD34 hematopoyéticas + las células madre son cultivadas con GM-CSF y TNF-α para derivar subconjuntos CD1a + y CD14 +, que entonces se diferencian además en Langerhanscomo las células y las células dendríticas. Por el contrario, los monocitos se cultivan en GM-CSF e IL-4 para generar moDCs inmaduros. Varios protocolos se utilizan para el enriquecimiento de los monocitos de sangre periférica; por ejemplo, por adherencia a placas de plástico, elutriación y kits de aislamiento 25, 26 Las ventajas del protocolo de adhesión son el mínimo daño a las células y relativamente rentable sin embargo célula pureza podría verse comprometida.; y un paso adicional se requiere para separar las células para experimentos adicionales. Elutriación es una técnica que separa las células en función de su tamaño y densidad. Las ventajas de elutriación son la viabilidad celular y los monocitos se pueden utilizar fácilmente para experimentos adicionales; sin embargo, esta técnica está limitada por la disponibilidad de un elutriador y la incapacidad para separar las diferentes poblaciones de células (células T y monocitos) con parámetros de sedimentación similares. Comercialmente disponibles kits de aislamiento utilizan microperlas magnéticas para seleccionar ya sea positiva oseleccionar negativamente a la población de monocitos. Algunos protocolos están sesgadas hacia el aislamiento de monocitos mediante la selección negativa, como los monocitos aislados permanecen "sin tocar" (que no esté obligado por marcas o microperlas). En este protocolo, perlas de CD14 se usaron para los monocitos humanos seleccione positivos de PBMCs. CD14 carece de un dominio citoplásmico y unión del anticuerpo a CD14 no desencadena la transducción de señales. Por otra parte, las microperlas se separará de los monocitos después del cultivo y, por tanto, no obstaculiza el proceso de diferenciación. Además, CD14 se expresa fuertemente en la mayoría de los monocitos y débilmente en los neutrófilos y algunas células dendríticas mieloides, por lo tanto, este método de los resultados de aislamiento en una mayor pureza de células que los otros métodos 17.
monocitos de sangre pueden ser diferenciadas en DCs o los macrófagos y el destino de los monocitos depende en gran medida sobre el medio ambiente de citoquinas. En este trabajo, moDCs se generan mediante la adición de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) Y la interleucina 4 (IL-4) a los monocitos de sangre periférica humana. Se requiere GM-CSF para la supervivencia de monocitos y la IL-4 ejerce una actividad inhibidora sobre la diferenciación de los macrófagos; y la adición combinatoria de GM-SCSF y IL-4 a los monocitos dió un mayor porcentaje de moDCs inmaduras en comparación con citoquinas individuales 27. Hay otros protocolos que generan moDCs mediante la adición de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interferón alfa (IFN-α) y la interleucina 13 (IL-13) para monocitos de sangre periférica 28, 29, 30. La combinación de GM-CSF e IL-4 se ha optimizado en la década de 1990 y ahora un protocolo aceptado que genera CD inmaduras de plástico diferenciadas en moDCs inmunogénicos o tolerogénicas y polarizadas en Th1, Th2 o Th17 moDCs promotoras.
moDCs inmaduros se diferencian en moDCs tolerogénicos por la adición de vitamina D3 y dexametasona. Hay varios protocolos para generar los DC tolerogénicos por ejemplo, a través deel factor nuclear kappa B (NF-kB) la inhibición, la activación de β-catenina, vitamina D3, dexametasona y rapamicina 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Aunque tanto la vitamina D3 y dexametasona sola se han reportado para inducir un efecto tolerogénico en países en desarrollo, la combinación de vitamina D3 y dexametasona resultado en una mayor supresión de la alloproliferation que cuando se utilizan los fármacos individuales. Por lo tanto, el protocolo existente para la generación de DCs tolerogénico se modificó para una combinación de vitamina D3 y dexametasona. Este método está siendo aceptado como un modelo para los países en desarrollo tolerogénicas humanos con una utilidad terapéutica. También es importante tener en cuenta que la vitamina D3 reconstituido y dexametasona tienen una vida útil corta.
En este protocolo, se añadió lipopolisacáridos (LPS) como inductor de la maduración de DC. moDCs inmaduros también pueden ser inducidas a la maduración usando cóctel pro-inflamatoria:(TNF-α), interleucina 1 beta (IL-1β), interleucina 6 (IL-6) y la prostaglandina E2) o citocinas pro-inflamatorias (TNF-alfa y el interferón gamma (IFN-Γ)). Cóctel Pro-inflamatorio genera moDCs maduros con funciones de alto co-estimuladoras y migratorias pero producen niveles relativamente bajos de IL-12 38. TNF-α o IFN-Γ por sí sola no es capaz de inducir un fenotipo dendríticas estable 39. LPS estimula Toll-like receptor 4 (TLR4), media la activación de NF-kB y activadas por mitógenos proteínas quinasas (MAPKs) para inducir la maduración de DC. DC maduración inducida por LPS muestra una sobre regulación de marcadores de maduración DC (CD83, CD86, HLA-DR) y también dio lugar a la producción de IL-12p70. Además, este paso puede ser modificado adicionalmente para emparejar LPS con agonistas de TLR3 para producir CD maduras para vacunas contra el cáncer clínicos. En este papel, los DC tolerogénicos se muestran para ser resistente a la maduración en el tratamiento LPS. Estos semi-maduros, como los países en desarrollo no son inmunogénicas y no lo hacen releaSE citoquinas pro-inflamatorias 40.
Las limitaciones de este protocolo se encuentran en el proceso de diferenciación. El proceso de toma 8 días desde el día 0 al día 7 que plantea una dificultad que ser adaptado en los análisis de alto rendimiento. Una modificación en el protocolo se requiere para acortar el proceso de diferenciación aún producir un gran número de países en desarrollo viables en los diferentes estados. En segundo lugar, los países en desarrollo se generan mediante la adición de citoquinas en este protocolo y estas citoquinas no corroboran la población CC por un largo período de tiempo. Por otra parte, las citoquinas se utilizan en concentraciones mucho más altas que en vivo y podría resultar en el desarrollo parcial de las vías que no son fisiológicamente idénticos a los DC in vivo. Por ejemplo, es cultivos in vitro de precursores de DC se ha demostrado que responder a GM-CSF, que no es una citoquina esencial para la diferenciación normal de DC in vivo 41. Sin embargo, la estimulación de citoquinas puede ser un método útil para genevaluar un gran número de DC in vitro para la experimentación. La posibilidad de someter estas células generadas a partir de este protocolo para otros análisis, tales como la tinción de inmunofluorescencia, citometría de flujo, alo estudios de reacciones metabólicas y estudios aumenta la utilidad de este método. Estos países en desarrollo in vitro sirven como un buen modelo para mejorar el conocimiento del desarrollo de la CC, la maduración y la presentación de antígenos, que es previamente difícil de hacer con los números raros de los DC in vivo.
Capacidad de los países en desarrollo 'para regular la inmunidad inmunológica frente a la tolerancia que los hace candidatos atractivos en la terapéutica contra el cáncer y enfermedades autoinmunes 42, 43, 44, 45. DCs inmunogénicas generados en este protocolo se puede utilizar para mejorar la eficacia de la vacunación contra las enfermedades infecciosas y tumores; mientras que los DC tolerogénicos pueden usarse para controlar las respuestas de células T no deseada y evitar rechazos después del trasplante. el intrincadoequilibrio entre la inmunidad y la tolerancia depende enormemente sobre el estado de diferenciación de DC. DC diferenciación celular es un programa coordinado que se rige por múltiples vías de señalización y destino metabólico. Los diferentes estados de diferenciación de DC difieren en las necesidades bioenergéticos y la biosíntesis; por ejemplo, las DC activadas requieren adaptaciones metabólicas más energéticas importantes para la supervivencia y la migración en comparación con los países en desarrollo en el estado de reposo. Es importante tener en cuenta que la vitamina D3, dexametasona y rapamicina son conocidos por su capacidad para inducir los DC tolerogénicos, se han descrito para influir en el metabolismo de DC. En este trabajo, el metabolismo energético de moDCs de diferentes estados de diferenciación se caracterizaron utilizando analizadores de flujo extracelulares y moDCs tolerogénicas exhibió la más alta maduración inducida por LPS plasticidad metabólica y la disminución de esta plasticidad. Metabolismo anabólico apoya maduración países en desarrollo, mientras que las influencias del metabolismo catabólico tolerogénico DC funciona 46. las CDgenerados a partir de este protocolo se puede utilizar para evaluar si la alteración del estado metabólico de los países en desarrollo son la clave para la modificación de la inmunidad y la tolerancia en la terapéutica. En conclusión, hemos presentado un protocolo para la generación de inmaduros, tolerogénico y moDCs maduros fundamental para el estudio de las funciones inmunorreguladoras PED.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Ciencia, Tecnología y Financiación Reasearch Core (a JEC).
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | PBMC isolation |
Syringe | Becton, Dickinson | 302832 | PBMC isolation |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | PBMC isolation |
15 mL falcon tube | Falcon | 352096 | PBMC isolation |
50 mL falcon tube | Falcon | 352070 | PBMC isolation |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | PBMC isolation |
0.2 µm filter | Sartorius stedim biotech | 17597 | PBMC isolation |
MACs kit | Miltenyi biotec | 130-042-201 | Monocyte enrichment |
MiniMACS Separator | Miltenyi biotec | 130-042-102 | Monocyte enrichment |
Cell culture grade water | Invitrogen, Life Technologies | Cell culture | |
RPMI | Gibco, Life Technologies | 11875-093 | Cell culture |
FBS | Hyclone | SH30070103 | Cell culture |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140 | Cell culture |
Phosphate Buffered Saline |
Gibco, Life Technologies | 10010-031 | Cell culture |
NEAA | Gibco, Life Technologies | 11140-040 | Cell culture |
EDTA | Gibco, Life Technologies | 15575 | Cell culture |
HEPES | Gibco, Life Technologies | 15630-080 | Cell culture |
Sodium Pyruvate | Gibco, Life Technologies | 11360-070 | Cell culture |
GM-CSF | Miltenyi biotec | 130-093-868 | Cell culture |
IL-4 | Miltenyi biotec | 130-093-924 | Cell culture |
Vitamin D3 | Sigma | D1530 | Cell culture |
Dexamethasone | Sigma | D2915 | Cell culture |
LPS | Sigma | l2755 | Cell culture |
trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
PerCP-conjugated HLADR | BioLegend | 307628 | Cytometry |
PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Cytometry |
PE-conjugated CD83 | BD Biosciences | 556855 | Cytometry |
PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Cytometry |
APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Cytometry |
PE-conjugated CD14 | Miltenyi biotec | 130-091-242 | Cytometry |
PE-conjugated BDCA3 | Miltenyi biotec | 130-090-514 | Cytometry |
APC-conjugated ILT3 | eBioscience | 12-5139-73 | Cytometry |
Isotype matched PerCP- conjugated Mab |
BioLegend | 400250 | Cytometry |
Isotype matched PE- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-835 | Cytometry |
Isotype matched APC- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-836 | Cytometry |
BD LSR II Flow Cytometer | BD Pharmingen | BD LSR II | Cytometry |
cytofix/cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Cytometry |
APC/CY7-conjugated CD25 | BD pharmingen | 557753 | Cytometry |
PE/CY7-conjugated CD4 | Biolegend | 300512 | Cytometry |
PerCP-conjugated CD3 | Biolegend | 300428 | Cytometry |
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit | STEMCELL Technologies | 19052 | Alloreaction study |
EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | Alloreaction study |
Cell Trace CFSE cell proliferation kit | Molecular probes | C34554 | Alloreaction study |
HBSS | Gibco, Life Technologies | 14025092 | Alloreaction study |
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 | BD Biosciences | 560889 | |
Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine magnetic bead panel |
Millipore | HCYTOMAG-60K | Cytokine analysis |
5 mL Polystyrene tube | Falcon | 352058 | Cytokine analysis |
Luminex Sheath Fluid | Millipore | SHEATHFLUID | Cytokine analysis |
FLEXMAP 3D system with xPONENT software | Luminex Corporation | FLEXMAP 3D | Cytokine analysis |
MitoTracker Red CMXRos | Cell Signalling | 9082 | Mitochondrial activity |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | Mitochondrial activity |
XF Assay Medium (OCR) | Seahorse Bioscience | 102352-000 | Metabolic adaptation |
Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | Metabolic adaptation |
XF Base Medium (ECAR) | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Metabolic adaptation |
L-glutamine | Gibco, Life Technologies | 25030-081 | Metabolic adaptation |
Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Metabolic adaptation |
XF Cell Mito Stress kit | Seahorse Bioscience | 103015-100 | Metabolic adaptation |
XF Glycolysis Stress kit | Seahorse Bioscience | 103020-100 | Metabolic adaptation |
Seahorse | Seahorse Bioscience | XFe96 | Metabolic adaptation |