Aquí se introduce una configuración experimental original para calentar células en un plato de cultivo usando radiación de láser de onda continua de 1,94 μm. Utilizando este método, se pueden investigar las respuestas biológicas de las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) después de diferentes exposiciones térmicas.
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Artículo de método
Láser de Thulium de onda continua para calentar las células cultivadas para investigar los efectos térmicos celulares
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Resumen
Resumen
Aquí se introduce un método original para calentar células cultivadas usando un láser de thulium de onda continua de 1,94 μm para la evaluación biológica. La radiación láser de túlio es fuertemente absorbida por el agua, y las células en el fondo del plato de cultivo son calentadas por difusión térmica. Una fibra láser con un diámetro de 365 μm se coloca aproximadamente a 12 cm por encima del plato de cultivo, sin ninguna óptica, de manera que el diámetro del haz de láser sea casi equivalente al diámetro interior del plato de cultivo (30 mm). Al mantener una cantidad constante de medio de cultivo en cada experimento, es posible irradiar las células con un aumento de temperatura altamente reproducible.
Para calibrar el aumento de temperatura y su distribución en un plato de cultivo celular para cada ajuste de potencia, se midió la temperatura durante 10 s de irradiación en diferentes posiciones ya nivel celular. La distribución de la temperatura se representó utilizando un software de gráficos matemáticosPrograma, y su patrón a través del plato de la cultura estaba en forma gaussiana. Después de la irradiación con láser, se pueden realizar diferentes experimentos biológicos para evaluar las respuestas celulares dependientes de la temperatura. En este manuscrito, se introduce la tinción de viabilidad ( es decir, distinguir las células vivas, apoptóticas y muertas) para ayudar a determinar las temperaturas umbral para la apoptosis celular y la muerte después de diferentes puntos en el tiempo.
Las ventajas de este método son la precisión de la temperatura y el tiempo de calentamiento, así como su alta eficiencia en células de calentamiento en un plato de cultivo de células enteras. Además, permite estudiar con una amplia variedad de temperaturas y duraciones de tiempo, las cuales pueden ser bien controladas por un sistema operativo computarizado.
Introducción
La comprensión de las respuestas biológicas celulares dependientes de la temperatura es de gran importancia para los tratamientos exitosos de hipertermia. La fotocoagulación láser retiniana con láser térmico, utilizada en oftalmología, es uno de los tratamientos con láser más establecidos en medicina. La luz visible, sobre todo de longitudes de onda verdes a amarillas, se utiliza en el tratamiento láser de la retina. La luz es altamente absorbida por la melanina en las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE), que forman la monocapa celular más externa de la retina. Ha habido un interés reciente entre los médicos y los investigadores en la irradiación térmica....
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Protocolo
1. Cultivo celular de RPE
- Aislamiento de células RPE de ojos porcinos
- Obtenga los ojos de porcino recién enucleados del matadero local. Manténgalos frescos (4 ° C) y en un ambiente oscuro.
- Quitar los tejidos extracelulares con tijeras y remojar los ojos en una solución antiséptica durante 5 min.
- Coloque los ojos en solución salina tamponada con fosfato esterilizada sin calcio y magnesio (PBS (-)) hasta su uso.
- Usando un bisturí, penetre la esclerótica a unos 5 mm por detrás del limbo corneal. Resect toda la parte anterior del ojo cortando con tijeras a través de todo, paralelo al limbo corneal. <....
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Resultados
Distribución de la temperatura después de diferentes ajustes de potencia
Todos los desarrollos de temperatura para cada irradiación simple se controlaron en la calibración de temperatura. A partir de estos datos, se obtuvo la temperatura máxima en el punto medido y se definió como T _ { max} (° C). Como se muestra en la Figura 3A , el programa se ejecutó en el momento en el que .......
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Discusión
Al discutir las respuestas celulares biológicas relacionadas con la temperatura, no sólo la temperatura, sino también la duración del tiempo de aumento de la temperatura, es importante, ya que la mayoría de los procesos bioquímicos son dependientes del tiempo. Particularmente en el campo de la hipertermia inducida por láser en oftalmología, debido al corto intervalo de tiempo -desde milisegundos a segundos- es difícil investigar los efectos térmicos celulares con un control preciso de la temperatura. Por lo tanto, se de.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención de investigación del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) (subvención # 13GW0043C) y una Oficina Europea de Investigación y Desarrollo Aeroespacial (EOARD, beca # FA9550-15-1-0443)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Águila Modificada' s Glucosa media - alta | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Añadir (2)-(4) antes de usar. Cálido en 37 ° C Baño de agua antes de usar. |
| Solución antibiótica antimicótica (100 ×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Contiene 10.000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina y 25 μ g Anfotericina B en 1 mL. Añadir 5,5 mL en un frasco mediano de 500 mL (1) antes de usar. |
| Piruvato de sodio (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Añadir 5,5 mL en un frasco mediano de 500 mL (1) antes de usar (concentración final: 1 mM) |
| Suero porcino | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Añadir 50 mL en 500 mL de bota mediana (1) antes de usar (final: 10%) |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Tripsina de páncreas porcino | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| VEGF humano Quantikine ELISA Kit | R& D System | DVE00 | |
| Oxiselect Kit de ensayo de glutatión total | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Kit de detección de células apoptóticas/necróticas/sanas | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| EquipmentsLáser de | |||
| tulio | Starmedtec GmbH | Prototipo | 0-20 W |
| Fibra de 365 mm de diámetro | central COMPONENTES LÁSER Alemania | CF01493-52 | |
| Termopar | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Placa calefactora | MEDAX | ||
| microplacas ( espectrofluorómetro) | Dispositivo molecular | Espectroramax | |
| QIAGEN | TissueLyser LT | ||
| Microscopio de fluorescencia | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| programa de software matemático | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| plataforma de diseño de sistemas | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
Referencias
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al.
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Reimpresiones y permisos
