We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.
Malgré la capacité de régénération du muscle squelettique, des déficits fonctionnels et / ou cosmétiques permanents (par exemple, la perte musculaire volumétrique (VML) résultant d' un traumatisme, d'une maladie et diverses affections congénitales, génétiques et acquises sont assez communs. L' ingénierie tissulaire et les technologies de médecine régénératrice ont un énorme potentiel pour fournir une solution thérapeutique. Cependant, l'utilisation de modèles animaux biologiquement pertinents en combinaison avec des évaluations longitudinales des mesures fonctionnelles pertinentes sont essentielles pour le développement de l'amélioration des thérapies régénératrices pour le traitement des blessures VML semblables. à cet égard, un système de levier musculaire commercial peut être utilisé pour mesurer la longueur, la tension, la force et les paramètres de vitesse dans le muscle squelettique. Nous avons utilisé ce système, en conjonction avec une puissance élevée, bi-phase de stimulateur, pour mesurer in vivo la production de force en réponse à l' activation du compartiment crural de le hindlimb de rat. Nous avons PREVIdemment utilisé cet équipement pour évaluer l'impact fonctionnel de blessure VML sur le muscle tibial antérieur (TA), ainsi que l'ampleur de la récupération fonctionnelle après traitement du muscle TA blessé avec notre ingénierie tissulaire réparation musculaire (TEMR) technologie. Pour ces études, le pied gauche d'un rat anesthésié est solidement ancré à un footplate relié à un servomoteur, et le nerf fibulaire commun est stimulée par deux électrodes aiguilles percutanées pour provoquer la contraction musculaire et la flexion dorsale du pied. Le nerf sciatique poplité externe induite par la stimulation-contraction musculaire est mesurée sur une gamme de fréquences de stimulation (1-200 Hz), pour assurer un plateau à terme dans la production de force qui permet une détermination précise de la force tétanique pointe. En plus de l'évaluation de l'ampleur du préjudice VML ainsi que le degré de récupération fonctionnelle après un traitement, cette méthode peut être facilement appliquée à l'étude des divers aspects de la physiologie musculaire et la physiopathologie. Une telle approche shoULD aider au développement plus rationnel des traitements améliorés pour la réparation musculaire et la régénération.
Le muscle squelettique a une capacité intrinsèque remarquable pour la réparation en réponse à une blessure ou d'une maladie 1,2. Expérimentalement, la robustesse de cette réaction de régénération a été bien documentée dans des modèles animaux en étudiant, par exemple, au cours du temps des dommages des muscles squelettiques, la réparation et la régénération après l' application de myotoxins (par exemple cardiotoxine) 3-7. Plus précisément, à la suite des dommages musculaires induits par cardiotoxine (38-67% des fibres musculaires 8), la régénération est médiée par les cellules satellites, les cellules souches résidentes qui mûrir pour devenir finalement des fibres musculaires fonctionnelles 4,9-13. Le résultat final est augmenté post-dommages régénération fonctionnelle de la santé, le tissu musculaire de force produisant 14-16. Bien que les détails sont bien au-delà de la portée de ce rapport, le mécanisme de base pour la régénération musculaire reflète les événements soigneusement orchestrées de nombreux types de cellules provenant de plusieurs lignées utilisant canonical signalisation des voies critiques à la fois le développement des tissus et de la morphogenèse 5,17-21. Surtout, la régénération induite myotoxine-est activée par le fait que la matrice extracellulaire, innervation neuronale et des vaisseaux sanguins perfusion restent structurellement intacte suivante induite cardiotoxine-lésion musculaire 3,8,22. À l'opposé, ces structures et composants des tissus clés sont, par définition, totalement absente dans le contexte de blessure VML; où la perte franche de tissu, en raison d'une variété de causes, se traduit par des déficits fonctionnels et esthétiques permanents 23-25.
Indépendamment des défis supplémentaires associés à la réparation musculaire et la régénération suite à une blessure VML en comparaison avec les dommages musculaires induits par myotoxine, une meilleure compréhension de la base mécanistique de régénération du muscle squelettique et la réparation, dans une variété de contextes, seraient bien servis par l'utilisation des biologiquement des modèles animaux pertinents en combinaison avec une direction longitudinalessessments de mesures fonctionnelles pertinentes. Comme décrit ici, les études de la patte arrière du rat constituent un excellent système modèle à cette fin. Plus précisément, les muscles de la loge crural (jambier antérieur, extensor digitorum longus (EDL) et hallicus longus (HL)), qui sont responsables de dorsiflexion du pied, sont facilement identifiés et manipulés. De plus, ils sont servis par les principaux vaisseaux sanguins (iliaques et branches), et sont innervés par les nerfs (sciatique et branches, y compris péronier) sur toute la longueur de la jambe 26-28. En tant que tel, on peut utiliser le modèle de hindlimb de rat pour évaluer directement le muscle squelettique fonction / pathologie in vivo, ou pour évaluer l'impact plus indirect des altérations liées à la pathologie dans les vaisseaux sanguins ou les nerfs sur la fonction musculaire squelettique correspondante. Dans les deux cas, la sévérité de la maladie, ainsi que l'efficacité du traitement peut être déterminée en fonction de la production de force musculaire (couple) et le pied correspondant mOUVEMENT 29-34.
Idéalement, les mesures de force sont accompagnées par des études histologiques et des analyses d'expression génique pour évaluer plus rigoureusement l'état structurel et moléculaire du muscle squelettique. histologie de base et immunohistochimie, par exemple, sont en mesure de répondre à des questions au sujet de la taille du muscle, l'alignement de la fibre musculaire, la composition de la matrice extracellulaire, l'emplacement des noyaux, le nombre de cellules, et la localisation des protéines. Analyse de l'expression génique, à son tour, est nécessaire pour identifier les mécanismes moléculaires qui peuvent influencer / moduler la maturité des fibres musculaires, des états pathologiques, et l'activité métabolique. Bien que ces méthodes fournissent des informations cruciales, ils représentent généralement extrémités terminales, et surtout, ils ne parviennent pas à traiter directement la capacité fonctionnelle du muscle squelettique, et donc, sont corrélatives plutôt que causal. Cependant, lorsque des études histologiques et des analyses d'expression génique sont évalués conjointement avec mesur fonctionnellees, alors, les mécanismes de production de la force et la régénération fonctionnelle peuvent être identifiés plus précisément.
À cet égard, la force de produire des capacités d'un muscle peut être mesurée in vitro, in situ ou in vivo. Les trois approches présentent des avantages et des limites. Dans une expérience in vitro, par exemple, le muscle est complètement isolé et retiré du corps de l'animal. En supprimant les influences des vaisseaux sanguins et les nerfs qui innervent le muscle, la capacité contractile du tissu peut être déterminée dans un environnement extérieur étroitement contrôlé 35. Dans l' essai de muscle in situ permet au muscle à isoler, comme des préparations in vitro, cependant , l'innervation et de l'approvisionnement en sang restent intacts. L'avantage du modèle expérimental in situ est qu'il permet un muscle individuel à étudier pendant l'innervation et de l' approvisionnement en sang est peu perturbé 36. À la foisin vitro et dans des expériences in situ, les traitements pharmacologiques peuvent être appliqués plus directement , sans avoir à tenir compte des effets de tous les tissus environnants ou l'impact du système circulatoire sur les réponses contractiles mesurées 37. Cependant, dans les tests de la fonction in vivo, tel que décrit ici, est la technique la moins invasive pour l' évaluation de la fonction musculaire dans son environnement natif 38, et peut être effectuée à plusieurs reprises au fil du temps ( par exemple, longitudinalement). En tant que tel, il sera le point focal de la discussion ci-dessous.
À cet égard, les électrodes percutanées insérées près du muscle d'intérêt, ou le nerf moteur qui sert, fournissent un signal électrique au muscle. Un capteur mesure alors la longueur ou la force des changements qui en résultent dans le muscle activé selon les instructions, un protocole de logiciel personnalisé prédéterminé. A partir de ces données, les propriétés physiques du muscle peuvent être déterminées. Ceux-ci comprennent,ce-fréquence, le tétanos maximale, force-vitesse, la raideur, la tension de la longueur, et la fatigue. la longueur du muscle ou de force peuvent également être maintenues constantes de sorte que les contrats musculaires isométrique ou isotonique. Fait important, ces protocoles expérimentaux peuvent être réalisés rapidement, facilement répétés et tous customized- alors que l'animal est anesthésié, et avec une période de récupération d'heures à quelques jours. Un seul animal peut subir es vigueur in vivo testant plusieurs fois, permettant ainsi des études longitudinales sur les modèles ou l' évaluation des thérapeutiques plates – formes / technologies maladie.
Comme décrit ici, un système de levier musculaire commercial en association avec une puissance élevée, biphase stimulateur est utilisé pour effectuer des tests de la fonction musculaire in vivo pour évaluer la contribution du muscle tibial antérieur de la patte postérieure du rat à la flexion dorsale du pied par stimulation de le nerf sciatique poplité externe. Nous avons mis au point un protocole qui est spécifiquement conçu pour évaluer la médecine régénérative / titechnologies d'ingénierie SSUE pour la réparation musculaire après une lésion traumatique VML du rat TA musculaire. Ça devrait être noté; l'EDL et HL doivent être disséqués hors du compartiment crural afin d'évaluer précisément le muscle TA (ils représentent environ 15-20% du couple total tibial antérieur mesurée après stimulation du nerf sciatique poplité externe (Corona et al., 2013) ). Parce que cette approche fournit une analyse longitudinale globale du muscle physiologie / fonction, il peut jeter une approche mécanistique importante sur de nombreux autres types d'enquêtes physiologiques ainsi que d' une variété de maladies ou domaines thérapeutiques 39. Par exemple, dans les tests de la fonction musculaire in vivo est applicable à des études de physiologie de l' exercice, l' ischémie / la recherche de reperfusion, la myopathie, des lésions nerveuses / neuropathie et vasculopathie, sarcopénie et dystrophies musculaires 40.
Ce protocole démontre une méthode relativement simple pour effectuer des tests de la fonction musculaire in vivo sur le compartiment crural antérieur de la patte arrière de rat. D' autres formes de tests de la fonction musculaire, y compris ex vivo et dans les protocoles in situ, peuvent également fournir des informations importantes sur la physiologie musculaire. Cependant, l'importance de l' essai in vivo de la fonction réside dans son caractère non invasif, et le fait qu'il récapitule plus précisément les mécanismes endogènes de stimulation musculaire. Pour les deux ex vivo et des essais in situ, le tendon et / ou musculaires es sont exposés, et par conséquent, doit être maintenu humide ou immergé 41,42. Des tests in vivo supprime les variables confondantes de traumatismes et de l' inflammation qui peuvent être causés par les interventions chirurgicales nécessaires dans les tests de la fonction musculaire in situ; ceci est particulièrement important si l'objectif de l'expérience est d'étudier les processus inflammatoires et cellulaires <sup> 43. En outre, les tests in vivo nécessite peu de compétences chirurgicales que le muscle ne soit pas isolé de son environnement et ne nécessite pas de noeuds précis pour réduire le muscle / tendon glissement (comme cela est le cas pour les essais in situ ou ex vivo) 41. En outre, avec une pratique suffisante, la vitesse de positionnement des électrodes correct et la capacité de faire rapidement des ajustements pour parvenir à une production du muscle force maximale veillera à ce que le protocole achèvement est rapide et reproducible- tant à l' intérieur des animaux et entre les différents utilisateurs du même équipement 39 . Il est utile de commencer par une évaluation de l'ensemble du composant antérieur crural comme illustré, avant l'excision des muscles synergiques moins accessibles (EDL et HL) pour plus d'investigation directe du muscle TA. En utilisant cette approche, on peut assez rapidement atteindre la maîtrise de la technique. Bien que la procédure décrite ici démontre et met en évidence l'utilité d'une force frprotocole equency pour induire le tétanos et déterminer la force maximale produite par un muscle, les utilisateurs devraient déterminer le type (s) de test fonctionnel qui serait le mieux informer leur expérience (s) spécifique et des objectifs de recherche.
Il y a plusieurs étapes essentielles qui doivent être effectuées avec soin afin de garantir des résultats expérimentaux optimaux et reproductibles, qui est, la production de force maximale cohérente par le muscle à une variété de paramètres de stimulation. Plusieurs des principales caractéristiques sont décrites dans la figure 2. Toutefois, le placement et la stabilité de l'électrode de stimulation appropriée est une condition sine qua non pour une stimulation maximale reproductible du nerf sciatique poplité externe. A cet égard, les électrodes doivent être placées superficiellement. Autrement dit, si le placement des électrodes est trop profond, on risque une stimulation électrique directe des muscles antagonistes, ce qui diminue l'amplitude de la réponse contractile observée du compartiment crural. En outre, ladeux électrodes doivent être placées dans le plus proche de l'autre que possible pour réduire la résistance électrique de la peau et du tissu conjonctif environnant. D'une manière générale, le positionnement de l'électrode à proximité du genou et médial de la jambe traçant directement le bord du jambier antérieur à l'endroit où elle rencontre le gastrocnémien donne souvent la production d'une force adéquate. Cela garantit également que les électrodes sont placées adjacentes et perpendiculaire au plan du nerf sciatique poplité externe, ce qui, à son tour, est perpendiculaire au tibia et latéralement vers le bas de la jambe au niveau du genou. Cependant, la variabilité naturelle de l'anatomie entre les animaux exige une vigilance constante pour veiller à ce que le placement des électrodes est optimisée sur la base de cas par cas. En tant que tel, il y a un certain niveau d'essai et d'erreur associée à la pose des électrodes qui est significativement diminuée par l'expérience de l'utilisateur. Le nombre de fois les électrodes percent la peau doit être minimisée pour réduire l'enflure et l'inflammation, ce qui me diminuela production de force asured. Cela dépend de l'endroit où les aiguilles sont tout d'abord placées, mais il est recommandé de déplacer les aiguilles de deux fois ou moins en particulier dans la zone autour de la rotule. Enfin, lorsque les électrodes sont placées dans la jambe de l'animal, des modifications mineures peuvent être apportées à la mise en place de la jambe et du courant délivré par les électrodes. Cela devrait être fait tout en surveillant simultanément la force produite à partir d'une seule secousse. En plus de la mise en place des électrodes, des ajustements peuvent être apportés à la tension délivrée aux bornes des électrodes. Cependant, dans la configuration décrite ici, il est important de faire preuve de prudence lorsque l'on augmente la tension comme un moyen d'augmenter la production de force parce que la tension accrue va stimuler les nerfs qui innervent les muscles antagonistes.
Il y a trois problèmes techniques clés qui doivent être surveillés pour veiller à ce que le placement des électrodes reste optimale. Tout d'abord, le pied de l'animal anesthésié doit être solidementancré à l'appareil de pédale de commande , qui mesure la production de force musculaire (figure 2). Si le pied est ancré solidement pas, la force réelle produite par le muscle peut être partiellement convertie en le transducteur de force. Fixation du pied Unstable introduit également le risque de perdre le placement optimal des électrodes en mouvement au – delà de la contraction musculaire normale (c. -à- pied se éloigner de la platine) peut provoquer le déplacement des électrodes à partir de leur position superficielle ou déloger complètement. Soit le scénario va diminuer la force mesurée. Deuxièmement, le corps de l'animal doit être complètement décubitus et aligné dans un plan rectiligne (Figure 2). Le positionnement correct du corps des animaux empêche de légers mouvements de la jambe due à la respiration, et minimise également la torsion de la jambe et du bassin, ce qui permet un meilleur positionnement et un contact continu des électrodes de stimulation. Troisièmement, le bon positionnement et d'ancrage du genou est critical pour veiller à ce que la jambe reste stable, et donc, contribue à stabiliser le placement optimal des électrodes de stimulation pour permettre l'activation cohérente du nerf sciatique poplité externe.
Il y a quelques points supplémentaires qui devraient être soulignés. Tout d'abord, le système de levier du muscle commercial est conçu pour effectuer des tests sur la jambe gauche, mais la configuration peut être modifiée pour effectuer des tests sur la jambe droite aussi bien. Deuxièmement, les systèmes de levier musculaires peuvent être choisis en fonction de la taille de l'animal, afin que les utilisateurs doivent veiller à ce que la plate-forme utilisée est adéquate pour mesurer et soutenir la force produite par le modèle animal de choix. muscles testables pour la plate-forme d'équipement sont limités à ceux qui induisent l'extension plantaire ou dorsiflexion du pied. Troisièmement, il convient encore de souligner que le placement des électrodes peut être difficile et exige de la patience et de pratique pour maîtriser la technique. Electrodes deviennent aussi terne rapidement avec une utilisation régulière, il est donc utile d'avoir plusieurs s de rechangeets pour une fois, il devient difficile de piquer la peau superficielle. En troisième lieu, le protocole décrit dans le présent rapport utilise des séquences de stimulation spécifiques et des procédures d'analyse des données. Le logiciel d'analyse de logiciels et les données de contrôle du système levier musculaire et les données qu'il fournit peut répondre à de nombreuses autres questions expérimentales et donc son utilité va au-delà ce qui est décrit ici. En tant que tel, les utilisateurs sont encouragés à explorer au-delà des limites du protocole logiciel (s) présenté dans cet article. En dépit de ces limitations mineures dans les tests de la fonction musculaire in vivo est une approche puissante pour déterminer la capacité du muscle squelettique santé et contractile , car il est peu invasive et peut être effectuée à plusieurs reprises, sur une période de temps prolongée, sur le même animal. En bref, ce type d'utilitaire réparable rend le système particulièrement habile à tester les effets de nouveaux traitements pour les lésions du muscle squelettique ou de la maladie dans le hindlimb de rat.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.
Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill | Vet Equip | 911103 | |
Inlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911124 | |
Outlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911125 | |
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VaporGuard Activated Charcoal Filter | Vet Equip | 931401 | |
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200 proof Ethanol | Decon labs | diluted to 70% with deionized water | |
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Dual Mode Lever System | Aurora Scientific Inc | Model 305C-LR-FP | contact manufacturer to order |
Signal Interface | Aurora Scientific Inc | Model 604A | |
High-Power, Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc | Model 701C | |
Data analysis software | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 software | |
Muscle lever system control software | Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 software |