Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

Summary

El siguiente protocolo describe la preparación y utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y ácidos grasos en el corazón de rata en funcionamiento aislado. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.

Abstract

El corazón de los mamíferos es un gran consumidor de ATP y requiere un suministro constante de sustratos de energía para la contracción. No es sorprendente, alteraciones del metabolismo del miocardio se han relacionado con el desarrollo de la disfunción contráctil y la insuficiencia cardíaca. Por lo tanto, desentrañar la relación entre el metabolismo y la contracción debe arrojar luz sobre algunos de los mecanismos que regulan la adaptación cardiaca o mala adaptación en estados de enfermedad. La preparación de corazón de rata aislado de trabajo se puede utilizar para seguir, de forma simultánea y en tiempo real, la función contráctil cardiaca y el flujo de la energía proporcionando sustratos en las vías metabólicas oxidativas. El presente protocolo tiene como objetivo proporcionar una descripción detallada de los métodos utilizados en la preparación y la utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y los ácidos grasos, la energía principal que proporciona sustratos del corazón. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.En resumen, la técnica se basa en el suministro de ¹⁴ C-glucosa marcada radiactivamente y un ácido graso de cadena larga radiomarcado ³ H- a un corazón latiendo a través de la perfusión ex vivo cristaloides normotérmica. ¹⁴ CO ₂ y ³ H ₂ O, subproductos finales de las reacciones enzimáticas implicadas en la utilización de estos sustratos de energía que proporciona, a continuación, se recuperaron cuantitativamente a partir del efluente coronario. Con el conocimiento de la actividad específica de los sustratos radiomarcados usados, es entonces posible cuantificar de forma individual el flujo de glucosa y ácidos grasos en las vías de oxidación. la función contráctil del corazón aislado se puede determinar en paralelo con el equipo de grabación apropiada y directamente correlacionado con los valores de flujo metabólico. La técnica es muy útil para estudiar la relación metabolismo / contracción en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como alteraciones en pre y después de la carga y de la isquemia, un fármaco o una Circulafactor de ting, o después de la alteración en la expresión de un producto génico.

Introduction

Relevancia clínica

En el corazón de los mamíferos, hay una fuerte relación positiva entre el flujo de sustratos a través de las vías metabólicas oxidativas, la generación de ATP y el trabajo cardíaco ^1. Durante las últimas dos décadas, la investigación de la intrincada relación entre el metabolismo y la función cardíaca se ha llevado a reconocer que las alteraciones en el metabolismo cardíaco son una causa para la disfunción contráctil y remodelación estructural posiblemente patológica en la fijación de diferentes tipos de enfermedades del corazón ^2-4. por lo tanto, se espera que nuestra comprensión de los mecanismos....

Protocol

NOTA: Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Política de Servicio de Salud Pública de los NIH sobre el Cuidado Humano y Uso de Animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Mississippi Medical Center. Todos los procedimientos que implican el uso de radioisótopos se aprobaron y se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por la oficina de la seguridad radiológica de la Universidad de Mississippi Medical Center.

1. Preparación de soluciones de estabilización y Reactivos

1. Krebs-Henseleit (KH) Soluciones para la reserva de estabi....

Results

Dos experimentos representativos se describen en las siguientes figuras. En ambos casos, se aisló el corazón de un 16 semanas de edad macho Sprague Dawley de rata perfundido y en el modo de trabajo con tampón KH preparado de acuerdo con el protocolo anterior. En cada experimento, el corazón se sometió a una condición de estrés para afectar el trabajo cardíaco. la función contráctil cardiaca se evaluó por registro continuo de la presión de pulso a través de la inserción de un transductor .......

Discussion

El protocolo anterior detalla los métodos para cuantificar simultáneamente el flujo de sustrato a través de la oxidación de la glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de trabajo. Las mediciones se pueden superponer a los parámetros funcionales cardíacos registrados, para determinar la relación entre el metabolismo de los sustratos y el trabajo cardíaco en condiciones basales y de estrés (cambio en la carga de trabajo, por isquemia-reperfusión, etc ...). También es posible evaluar c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro de sodio (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Cloruro de potasio (KCl)	Fisher Scientific	BP366
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)	Fisher Scientific	P284
Sulfato de magnesio Heptahidrato (MgSO4*7H2O)	Fisher Scientific	M63
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Fisher Scientific	S233
Cloruro de calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
AG 1-X8 resina, forma de cloruro, tamaño de malla seca 100 - 200, 500 g	Bio-Rad	1401441	Este artículo se puede reemplazar comprando directamente la forma de óxido de hidrógeno  (ver referencia más abajo), pero esto costará casi 8 veces más
resina AG 1-X8, forma de hidróxido, tamaño de malla seca de 100 a 200, 100 g	de 1432445 Bio-Rad		La compra de este artículo permite evitar la conversión de la resina de intercambio aniónico de la forma de cloruro a la forma de hidróxido (ver sección 1.2 del protocolo)
Microanálisis de vidrio Portafiltros al vacío	Fisher Scientific	09-753-2
Hidróxido de sodio (NaOH)	Fisher Scientific	S318	Corrosivo. Consulte la MSDS del producto para conocer su manejo y almacenamiento adecuados.
Tubo de dispersión de gas con cilindro fritado	Fisher Scientific	11-138B
Probumin Albúmina sérica bovina sin ácidos grasos, polvo	EMD Millipore	820027	Recomendamos el uso de un BSA desgrasado con carbón, ya que otros procesos de purificación, como el fraccionamiento de etanol en frío, pueden dejar residuos tóxicos para el corazón.
Oleato de sodio	Sigma-Aldrich	O7501
Ácido oleico, [9,10-3H(N)]-	PerkinElmer	NET289005MC	Material radiactivo. Siga las pautas de la oficina de seguridad radiológica de su institución para realizar pedidos y manipularlos.
Tubo de membrana de diálisis, 29 mm de diámetro	Fisher Scientific	08-667E
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G7021
Glucosa, D-[14C(U)]-	PerkinElmer	NEC042B005MC	Material radiactivo. Siga las pautas de la oficina de seguridad radiológica de su institución para realizar pedidos y manipularlos.
Humulin R U-100	Eli Lilly and Company	NDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin Hydrate	Sigma-Aldrich	T133	Sustancia controlada en USDEA Schedule III
3-0 Silk Black Braid	Roboz Surgical	SUT-15-3
10x Hyamine Hydroxide	PerkinElmer	6003005	Altamente tóxico y causa quemaduras graves. Consulte la hoja de datos de seguridad del producto para un manejo y almacenamiento adecuados Viales
centelleo de vidrio de 20 ml	Fisher Scientific	03-341-25E	Utilice viales de vidrio para la recuperación cuantitativa de 14CO2
20 ml Viales de centelleo de HDPE	Fisher Scientific	03-337-23B	Utilice viales de HDPE para la recuperación cuantitativa de 3H2O
Red Tapones de goma	Fisher Scientific	14-126DD	Fit viales de centelleo de 20 mL; Aguja BD
PrecisionGlide reutilizable 23G x 40 mm	BD	305194	Úselo para inyectar ácido perclórico a través del tapón de goma de la trampa de CO2
Ácido perclórico, 60%	Fisher Scientific	A228	Altamente corrosivo y puede actuar como oxidante y/o causar un peligro de explosión. Consulte la ficha de seguridad del producto MSDS para un manejo y almacenamiento adecuados
Ultima Gold, Scintillation Cocktail	PerkinElmer	6013327
Lana de vidrio	Fisher Scientific	AC38606
Decon Dri-Clean Detergente en polvo	Fisher Scientific	04-355	Para la limpieza de cristalería, piezas de plástico y tubos
Alconox Tergazyme Detergente con energía enzimática	Fisher Scientific	16-000-115	Para la limpieza de superficies de "difícil acceso" (tubos, cristalería) contaminadas por residuos de ácidos grasos-BSA