Describimos un protocolo para la filtración de muestras de agua con un cartucho de filtro y la extracción de ADN ambiental (eDNA) sin tener que abrir la carcasa para quitar el filtro. Este protocolo está desarrollado para el metabarcoding del eDNA de los peces, pero también es aplicable al eDNA de otros organismos.
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Artículo de método
El uso de un cartucho de filtro para la filtración de agua Las muestras y extracción de ADN del Medio Ambiente
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Resumen
Resumen
Estudios recientes demostraron que el uso del ADN ambiental (ADNe) de los peces es apropiado como herramienta de monitoreo no invasiva. La mayoría de estos estudios emplearon filtros de fibra de disco para recolectar eDNA de muestras de agua, aunque varios estudios microbianos en ambientes acuáticos han empleado cartuchos de filtro, porque el cartucho tiene la ventaja de acomodar grandes volúmenes de agua y de facilidad de uso en general. Aquí proporcionamos un protocolo para la filtración de muestras de agua utilizando el cartucho de filtro y la extracción de eDNA del filtro sin tener que abrir la carcasa. Las partes principales de este protocolo consisten en: 1) filtración de muestras de agua (volúmenes de agua ≤4 L o >4 L); (2) extracción de ADN en el filtro utilizando un agitador de rodillos colocado en una incubadora precalentada; y (3) purificación de ADN utilizando un kit comercial. Con el uso de este y otros protocolos utilizados anteriormente, realizamos un análisis de metabarcoding de ADNe tomado de un enorme tanque de acuario (7.500m3) con composición de especies conocida, y mostramos el número de especies detectadas por biblioteca de los dos protocolos como resultados representativos. Este protocolo se ha desarrollado para el metabarcoding del eDNA de los peces, pero también es aplicable al eDNA de otros organismos.
Introducción
ADN Ambiental (Edna) en los ambientes acuáticos se refiere a material genético que se encuentra en la columna de agua. Estudios recientes han demostrado la utilidad de Edna para la detección de peces de diferentes ambientes acuáticos, incluyendo estanques, ríos 1-3 4-8, corrientes 9, 10-14 y agua de mar. La mayoría de estos estudios se centraron en la detección de una sola o unas pocas invasiva 1,4-6,8,14 y especies raras o amenazadas 3,9, mientras que algunos estudios recientes intentaron detección simultánea de múltiples especies en las comunidades locales de pescado 7,9, 12,13,15 y mesoco....
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Protocolo
NOTA: Este protocolo no aborda los métodos de toma de muestras de agua y metabarcoding. El agua puede tomarse muestras de diferentes maneras dependiendo de los propósitos del estudio 16 y vea Miya et al. 12 para detalles de los métodos que utilizan cebadores metabarcoding MiFish. Tenga en cuenta que el agua en la muestra se debe mantener muy frío y se filtró dentro de unas pocas horas para evitar la degradación de Edna. Tenga en cuenta también que este protocolo implica el uso de un agitador rotatorio y una incubadora, y este último debe ser lo suficientemente grande para dar cabida a la primera. Además, una centrífuga que puede acomoda....
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Resultados
Técnicamente es difícil de aislar y cuantificar solamente Edna peces de la Edna mayor extraído, ya que los cebadores MiFish coamplify la región diana de algunos vertebrados que no son peces, como las aves y los mamíferos, con productos de PCR del mismo tamaño (aprox. 170 pb ) 12. En lugar de cuantificar los peces a Edna, realizamos MiFish metabarcoding análisis de Edna desde un tanque de acuario con la composición de especies conocidas utilizando los dos métodos difer.......
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Discusión
En muchos estudios metabarcoding utilizando muestras ambientales tales como el agua y el suelo, el tratamiento post-filtración del cartucho de filtro es generalmente como sigue 24,25: 1) de corte abierto o formación de grietas de la carcasa con herramientas de mano (cortador de tubos o pinzas); 2) la retirada del filtro del cartucho; y 3) cortar el filtro en pequeños trozos con una cuchilla de afeitar para la extracción de ADN. Para evitar este tipo de varios métodos de extracción de ADN engorroso y consume m.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado como investigación básica por CREST de la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología (JST) y por subvenciones de JSPS/MEXT KAKENHI (Número 26291083) y la Fundación Canon a M.M. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Panel de malla | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Punta metálica | Iris Ohyama | MR12F | |
| Soporte para el panel de malla | Sin marca | 4184-9507 | disponible en Amazon Japón Bolsa de |
| plástico de 1 L con tapón de rosca | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Conector luer-lock macho | ISIS | 11620 | |
| Punta de pipeta de 10 ml | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| Botella de libro de 10 L con válvula | As One | 1-2169-01 | |
| Filtro Sterivex-HV | Millipore | SVHVL10RC | denotado como "cartucho de filtro" en todo el ms y utilizado en el protocolo |
| Racor luer macho | As One | 1-7379-04 | |
| Racor luer hembra | As One | 5-1043-14 | |
| Tapón luer de entrada | ISIS | VRMP6 | |
| Tapón luer de salida | ISIS | VRFP6 | |
| Tubo de alto vacío | Como uno | 6-590-01 | |
| Conector de vacío | Como uno | 6-663-02 | |
| Tapón de silicona | Como uno | 1-7650-07 | |
| Colector | Como uno | 2-258-01 | |
| Aspirador-GAS-1 | Como Uno | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Kit de pañuelos (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Kit de aislamiento de ADN Sterivex MO | BIO | 14600-50-NF | denotado como "kit opcional" en el ms |
| Centrífuga de mesa | Kubota | modelo 4000 | Velocidad máxima 6.000 rpm |
| Rotor de ángulo fijo | Kubota | AT-508C | |
| Adaptador para tubo cónico de 15 ml | Kubota | 055-1280 | |
| Solución de estabilización RNAlater | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denotado como "película autosellante" |
Referencias
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584(2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE....
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Reimpresiones y permisos
