El virus del Zika (ZIKV), un patógeno emergente, está relacionado con anomalías del desarrollo fetal y microcefalia. El establecimiento de un sistema eficaz de cultivo de células infecciosas es crucial para los estudios de replicación del ZIKV, así como para el desarrollo de vacunas y fármacos. En este estudio, se ilustran y discuten varios ensayos virológicos relacionados con el ZIKV.
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Artículo de método
Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la
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Resumen
Resumen
Zika Virus (ZIKV) es un patógeno emergente que está vinculado a anomalías en el desarrollo del feto, como microcefalia, defectos oculares y problemas de crecimiento. ZIKV es un virus ARN de la familia Flaviviridae. ZIKV se transmite principalmente a través de los mosquitos, pero también puede ser transmitida por la madre a la transmisión vertical del feto, así como el contacto sexual. Hasta la fecha, no existen opciones de tratamiento o vacunas fiables disponibles para proteger a las personas infectadas por el virus. El desarrollo de un sistema reproducible y eficaz de virus Zika infecciosa cultivo celular es fundamental para el estudio de los mecanismos moleculares de la replicación ZIKV así como el desarrollo de medicamentos y vacunas. En este sentido, se informa aquí un protocolo que describe un sistema de mamífero basado en células in vitro Zika virus de cultivo para el análisis de la producción y el crecimiento viral. Se presentan detalles sobre la formación de placas por el virus Zika en una monocapa de células y la placa de ensayo para medir el título viral. la cinética de replicación del genoma viraly los intermedios replicatory de doble cadena de ARN del genoma se determinan. Esta plataforma de cultivo se utiliza para la pantalla contra una biblioteca de un pequeño conjunto de citoquinas que resultan en la identificación de interferón α (IFN-α), IFN-β y IFN-γ como inhibidores potentes de crecimiento viral Zika. En resumen, un sistema in vitro infecciosa viral Zika la cultura y diversos ensayos virológicos se ponen de manifiesto en este estudio, que tiene el potencial de beneficiar en gran medida la comunidad de investigación para dilucidar aún más los mecanismos de patogénesis viral y la evolución de la virulencia del virus. Antiviral de IFN-alfa más se puede evaluar como profiláctico posterior a la exposición, y la opción profiláctica, el tratamiento de las infecciones por virus Zika en poblaciones de alto riesgo, incluidas las mujeres embarazadas infectadas.
Introducción
Zika Virus (ZIKV) es un importante patógeno humano asociado con microcefalia y los pobres resultados del embarazo 1,4. ZIKV pertenece al conjunto de los flavivirus médicamente relevantes que pueden causar defectos neurológicos tales como el dengue, del Nilo Occidental, y virus de la encefalitis de San Luis. El principal modo de transmisión viral es por el mosquito vector Aedes aegypti, y, además, la transmisión sexual también se ha informado de 5,6. ZIKV se ha convertido en un problema de salud mundial importante debido a la expansión de la distribución geográfica del mosquito vector y su fuerte correlación con defectos de nacimiento. Z....
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Protocolo
Nota: Un plan esquemático del flujo de trabajo se presenta en la Figura 1.
1. Las células
- Utilizar células Vero para la producción de virus Zika y análisis de ciclo de replicación viral.
- Preparar medio completo de crecimiento que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 unidades / ml), y HEPES 10 mM.
- Células Vero de cultivo con el medio de crecimiento completo especificado a 37 ° C con 5% de CO 2.
2. Zika Virus Producción
- Recoger las células Vero a una densidad celu....
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Resultados
Una cepa viral Zika (PRVABC59; número de acceso GenBank KU501215) del genotipo asiático se utilizó en este estudio 12. Se utilizaron células Vero a 80% de confluencia para la investigación de novo infección viral Zika. Para la producción viral y caracterización virológica posterior, se empleó un paso precoz del virus (P3) Zika. Se observaron las placas virales en el segundo día de la infección. Zika progenie viral liberados de la célula infectada puede transmitir inic.......
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Discusión
Aquí, se presenta un protocolo simplificado para el cultivo de virus Zika in vitro. Los pasos críticos incluyendo, identificando los puntos finales óptimas para la expansión del cultivo del virus, la medición de título, y se proporcionaron cuantificar la replicación del genoma. virus Zika es un patógeno humano, por lo que, durante la manipulación de agentes infecciosos, los procedimientos de bioseguridad deben ser seguidas estrictamente. Una línea de células de riñón de mono, Vero, se utilizó para la demostraci.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Aaron Brault y a la Dra. Brandy Russell de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), EE.UU. por proporcionar la cepa viral del Zika PRVABC59. Agradecemos a Nicholas Ten de la Universidad de Yale por la edición de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Premio Institucional de Investigación Programática del Centro Médico Cedars-Sinai a V.A.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Tripsina, 10x [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Tinte azul tripán 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Condesa – Contador de células automatizado | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Recuento de células de Condesa portaobjetos de cámara | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| anticuerpo monoclonal anti-dsRNA para ratón J2 | Inglés & Consultoría Científica Kft. | ||
| Cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX con ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Sistema de PCR en tiempo real | Thermo Fischer | 4471088 | |
| DNasa libre de ARNasa | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Cepa viral del Zika PRVABC59 | Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alfa | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alfa | Peprotech | 300-01A | |
| Interferón alfa A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferón beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferón gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrífuga 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrífuga 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Microscopio de inmunofluorescencia con Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visita Nikon a petición |
Referencias
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al.....
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Reimpresiones y permisos
