Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Yilin Wang; Pakorn Kanchanawong

doi:10.3791/54774

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Artículo de método

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

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DOI:

10.3791/54774

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1 de diciembre de 2016

Yilin Wang¹ , Pakorn Kanchanawong²^,³

¹Department of Biology, South University of Science and Technology of China, Shenzhen, ²Mechanobiology Institute, Singapore, ³Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para la aplicación de interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm), un método súper resolución microscopía 3-dimensional de una sola molécula de localización, a la formación de imágenes del citoesqueleto de actina en células de mamífero adherentes. Este enfoque permite la visualización basada en la luz de las características estructurales a nanoescala que de otro modo permanecerían sin resolver por microscopía óptica de difracción limitada convencional.

Resumen

Microscopía de fluorescencia permite la visualización directa de biomoléculas específicas dentro de las células. Sin embargo, para la microscopía de fluorescencia convencional, la resolución espacial está limitada por difracción a ~ 200 nm dentro del plano de la imagen y> 500 nm a lo largo del eje óptico. Como resultado, la microscopía de fluorescencia ha sido durante mucho tiempo muy limitada en la observación de características ultraestructurales de las células. El reciente desarrollo de métodos de microscopía súper resolución ha de superar esta limitación. En particular, el advenimiento de fluoróforos photoswitchable permite súper resolución microscopía basada en la localización, que proporciona el poder de resolución acercarse a la escala de longitud molecular. A continuación, describimos la aplicación de un método de resolución de la microscopía de súper tridimensional basado en una sola molécula de microscopía de localización y la interferometría de fases múltiples, llamado interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm). Este método proporciona una resolución casi isotrópica en elorden de 20 nm en las tres dimensiones. Los protocolos para visualizar el citoesqueleto de actina filamentosa, incluyendo la preparación de muestras y el funcionamiento del instrumento iPalm, se describen aquí. Estos protocolos son también fácilmente adaptable e instructivo para el estudio de otras características ultraestructurales de las células.

Introducción

La visualización de las estructuras celulares complejas ha sido durante mucho tiempo parte integral de conocimientos biológicos y descubrimiento. Aunque la microscopía de fluorescencia puede celdas de imagen con especificidad molecular alto, su poder de resolución está limitada por la difracción a ~ 200 nm en el plano de la imagen (x, y, o dimensión lateral) y> 500 nm a lo largo del eje óptico (z, o dimensión axial) ^1,2. Por lo tanto, la observación de características ultraestructurales históricamente se ha limitado a la microscopía electrónica (EM). Afortunadamente, el reciente desarrollo de la resolución microscopía de súper ha eludido este límite, lo qu....