Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

Resumen

Recientemente se han desarrollado varios biosensores de fuerza basados en FRET, que permiten la resolución de la fuerza intracelular específica de la proteína. En este protocolo, demostramos cómo uno de estos sensores, diseñado para el enlazador de la proteína del complejo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, se puede utilizar para medir las fuerzas de actomiosina en el complejo nuclear LINC.

Resumen

Se ha planteado la hipótesis de que el complejo LINC es la estructura crítica que media la transferencia de fuerzas mecánicas desde el citoesqueleto hasta el núcleo. Nesprin-2G es un componente clave del complejo LINC que conecta el citoesqueleto de actina con las proteínas de membrana (proteínas de dominio SUN) en el espacio perinuclear. Estas proteínas de membrana se conectan a las láminas dentro del núcleo. Recientemente, se clonó una sonda de fuerza de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster en mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (sensor de tensión)) y se utilizó para medir la tensión a través de Nesprin-2G en fibroblastos NIH3T3 vivos. Este artículo describe el proceso de uso de Nesprin-TS para medir las fuerzas del complejo LINC en fibroblastos NIH3T3. Para extraer información FRET de Nesprin-TS, también se presenta un esquema de cómo mezclar espectralmente imágenes espectrales sin procesar en canales fluorescentes aceptores y donantes. Mediante el uso de software de código abierto (ImageJ), las imágenes se preprocesan y se transforman en imágenes radiométricas. Finalmente, se presentan los datos FRET de Nesprin-TS, junto con estrategias sobre cómo comparar datos entre diferentes grupos experimentales.

Introducción

Sensible a la Fuerza, los sensores FRET codificados genéticamente han surgido recientemente como una herramienta importante para la medición de fuerzas de tracción a base de en células vivas, proporcionando información sobre cómo las fuerzas mecánicas son aplicada a través de proteínas de ^{1, 2, 3, 4.} Con estas herramientas, los investigadores pueden tomar imágenes de forma no invasiva fuerzas intracelulares en células vivas utilizando microscopios fluorescentes convencionales. Estos sensores consisten en una FRET-par (proteínas donantes y f....

Protocolo

1. Obtener ADN Sensor nesprin-2G y otro ADN plásmido

1. Obtener nesprin-2G TS (sensor de tensión) de control, nesprin-2G HL (sin cabeza), mTFP1, venus, y TSmod de una fuente comercial. Propagar todos los plásmidos de ADN y purificarlos usando cepas estándar de E. coli, tales como DH5-α, como se ha descrito previamente ^{12, 13.}

2. Las células transfectar con nesprin-2G y otro ADN plásmido

1. Se cultivan las células de fibroblastos NIH 3T3 a 70-90% de confluencia en una placa de cultivo celular de 6 pocillos en un incubador de cultivo celular estándar c....

Resultados

Siguiendo el protocolo anterior, el plásmido de ADN fue adquirido desde el repositorio de ADN y se transformó en células de E. coli. E. coli que expresan el DNA sensor fueron seleccionados de placas LB / ampicilina y se amplificaron en un caldo LB líquido. Después de la amplificación de los vectores, los plásmidos de ADN se purificaron en tampón Tris-EDTA utilizando un estándar, disponible comercialmente kit de aislamiento de ADN. El uso de un espectrofotómetro, el ADN .......

Discusión

Un método y la demostración de imágenes de células vivas de la tensión mecánica a través de nesprin-2G, una proteína en el complejo nuclear de LINC, se esbozó anteriormente. Antes de este trabajo, varias técnicas, tales como la aspiración de micropipeta, magnético en perlas de citometría, y microscópica láser de ablación, se han utilizado para aplicar tensión en el núcleo de la célula y para medir sus propiedades de material a granel ^{16, 17,}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nesprin-TS ADN	Addgene	68127	Recuperar de https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL ADN	Addgene	68128	Recuperar de https://www.addgene.org/68128/
mTFP1	ADN Addgene	54613	Recuperar de https://www.addgene.org/54613/
mVenus ADN	Addgene	27793	Recuperar de https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Recuperar de
células https://www.addgene.org/26021/ competentes Bioline	BIO-85026
Medios LB líquidos	ThermoFisher		10855001 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Placas de cultivo bacteriano LB sólido	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US
ampicilina	Sigma	A9518
	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
cubeta de cuarzo	Biorad	1702504	Cubeta para SmartSpec Plus
kit de aislamiento de ADN	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
placa de cultivo celular de 6 pocillos	Falcon-Corning	353046	Multipocillo Placa de cultivo de polistrene de 6 pocillos
Medio Eagle modificado de Dulbecco, (DMEM) medios celulares	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Suero bovino	Life Technologies	16170-078
Medios celulares de suero reducido	Gibco	31985-070	Medio de suero reducido, lipídico "optimem"
Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Reactivo lipídico, "Lipofectamine 2000"
1,5 mL tubo de plástico estéril	Denville	c2170
Tripsina	Gibco	25200-056	0,25% Tripsina-EDTA (1x)
plato de visualización para microscopio con fondo de vidrio	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	Plato de 35 mm con pozo de fondo de 20 mm #1.5 vidrio
Fibronectina	ThermoFisher	33016015	fibronectina proteína humana, plasma
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	14190-144	de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
15 mL	Greiner bio-one	188261
	Thermo electron	Centra CL2	Rotor oscilante thermo electron 236
campana de bioseguridad para cultivos celulares	Forma Scientific	1284
incubadora de cultivos celulares climatizados	ThermoFisher	3596
Microscopio fluorescente de campo amplio LED invertido	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES Medios de imagen tamponados	Sondas moleculares
Suero fetal bovino Serum	Life technologies	10437-028
Confocal invertido con temperatura controlada con fuentes láser de 458 y 515 nm	Zeiss	LSM 710-w/detector espectral META
Medios de crecimiento externo	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblastos	ATCC	CRL-1658

Espectrofotómetro de Tubo de centrífuga estéril Centrífuga de rotor oscilante A14291DJ