Aquí, se describen los protocolos experimentales para preparar Drosophila en diferentes etapas de desarrollo y realizar imágenes ópticas longitudinales de los latidos del corazón de Drosophila utilizando un sistema de microscopía de coherencia óptica (OCM) personalizado. Los cambios morfológicos y dinámicos cardíacos se pueden caracterizar cuantitativamente mediante el análisis de los parámetros estructurales y funcionales del corazón a partir de imágenes de OCM.
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Artículo de método
Drosophila Preparación e Imagen longitudinal de la función cardiaca in vivo utilizando microscopía de coherencia óptica (OCM)
En este artículo
Resumen
Resumen
El estudio longitudinal de los latidos del corazón en animales pequeños contribuye a la comprensión de los cambios estructurales y funcionales durante el desarrollo del corazón. Se ha demostrado que la microscopía de coherencia óptica (OCM) es capaz de obtener imágenes de corazones de animales pequeños con alta resolución espacial y velocidad de imagen ultra alta. El alto contraste de imagen y las propiedades no invasivas hacen que la OCM sea ideal para realizar estudios longitudinales sin necesidad de disecciones o tinciones de tejido. Drosophila ha sido ampliamente utilizado como organismo modelo en estudios de desarrollo cardíaco debido a su alto número de genes de enfermedades humanas ortólogas, su similitud de mecanismos moleculares y vías genéticas con vertebrados, su corto ciclo de vida y su bajo costo de cultivo. Aquí, se describen los protocolos experimentales para la preparación de Drosophila y la obtención de imágenes ópticas de los latidos del corazón con un sistema OCM personalizado a lo largo del ciclo de vida del espécimen. Siguiendo los pasos proporcionados en este informe, se pueden adquirir imágenes transversales en modo M y OCM 3D para realizar estudios longitudinales de la morfología y función cardíaca de Drosophila. También se demostró que las imágenes OCM de sección frontal y axial y los histogramas de frecuencia cardíaca (FC) y período de actividad cardíaca (CAP) analizan los cambios estructurales del corazón y cuantifican la dinámica cardíaca durante la metamorfosis de Drosophila, combinados con los videos construidos con imágenes en modo M para rastrear la actividad cardíaca de manera intuitiva. Debido a la similitud genética entre Drosophila y los vertebrados, el estudio longitudinal de la morfología y la dinámica del corazón en las moscas de la fruta podría ayudar a revelar los orígenes de las enfermedades cardíacas humanas. El protocolo aquí proporcionaría un método efectivo para realizar una amplia gama de estudios para comprender los mecanismos de las enfermedades cardíacas en los seres humanos.
Introducción
Estudio longitudinal del corazón en animales pequeños contribuye a la comprensión de una variedad de enfermedades cardiovasculares relacionadas humanos, tales como defectos cardíacos congénitos relacionados con el gen 1,2. En las últimas décadas, diversos modelos animales, tales como 3,4 ratón, Xenopus 5,6, 7,8 pez cebra, aviar 9, y Drosophila 10-16, se han utilizado para llevar a cabo el corazón-desarrollo humano investigación relacionada. El modelo de ratón se ha utilizado ampliamente para estudiar el desarrollo cardíaco normal y anormal y fenotipos defecto cardíaco debido a sus similitudes ....
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Protocolo
1. Preparación del sistema OCM de Imagen Óptico de Drosophila 16
- Seleccionar un espectrómetro y una cámara de exploración de líneas de alta velocidad que proporciona una velocidad de al menos 80 cuadros / seg por lo que el sistema OCM será capaz de resolver el latido del corazón de Drosophila.
- Utilice una fuente de luz de banda ancha para garantizar una resolución axial de 2 micras para identificar la estructura del corazón de Drosophila.
- Utilice un objetivo de 10X para obtener una alta resolución transversal.
- Use un espejo de 45 ° varilla para reflejar el haz de luz del brazo de referenci....
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Resultados
La imagen cardiaca longitudinal se llevó a cabo utilizando las moscas de la fruta con el 24B-GAL4 + cepa / a temperatura ambiente con OCM. Las mediciones se realizaron a L2, L3, y cada 8 hr de PD1 a PD4, y de día para adultos 1 (AD1) para realizar un seguimiento del proceso de la metamorfosis (Tabla 1). Larva, pupa temprana, pupa y adulto finales de moscas fueron montados en las placas de vidrio como se ve en la figura 1A. Las características del segmento del corazón para las moscas lar.......
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Discusión
El rápido latido del corazón de Drosophila, con una frecuencia cardíaca máxima alrededor de 400 latidos por minuto en las etapas de larvas y adultos, requiere una alta velocidad de imágenes para resolver los diástole del corazón y sístole (no menos de 80 cuadros / seg sobre la base de experiencias). Debido al pequeño tamaño de la cámara del corazón y micras espesor de la incrustación pared del corazón (5-10 micras), una alta resolución espacial (mejor que 2 micras) se requiere para la resolución de las estructu.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses relacionados con el presente estudio.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Start-Up de la Universidad de Lehigh, el NIH (R00EB010071 a C.Z., R15EB019704 a C.Z. y A.L., R03AR063271 a A.L., y R01AG014713 y R01MH060009 a R.E.T.), la NSF (1455613 a C.Z. y A.L.), el Fondo para la Cura del Alzheimer (a R.E.T.) y el Hospital General de Massachusetts (Premio del Comité Ejecutivo de Investigación a A.L.). M.C. y Y.M. fueron apoyados por el Programa Nacional de Investigación Básica Clave de China (Programa 973) en virtud de la Subvención Nº 2014CB340404.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema de imagen OCM personalizado | Desarrollado en nuestro laboratorio | ||
| my Temp Mini Incubadora Digital | Benchmark H2200-HC | ||
| Cubierta de vidrio | AmScope | 200PCS | |
| algodón | RITE AID | ||
| Fórmula instantánea de Drosophila Fórmula | CAROLINA | 4-24 | |
| Levadura | ActiveDry | ||
| Microscopio | SONY | WILD M420 | |
| Brush | Loew-Cornell | 245B | se utiliza para mover muestras |
| Labview | National | ||
| ImageJ | Institutes of Health | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Pinza | Wiha | AA SA | para fijar la fruta alas de mosca |
| FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
| Cinta adhesiva permanente de doble cara escocesa, pipeta | escocesa | ||
| Fisherbrand | MU18837 | ||
| Aceite de coco extra orgánico | Spring Valley | 13183 | |
| Portaobjetos de microscopio | CapitolMarca | M3504-E | |
| Drosophila Viales | SEOH | 8401SS | |
| All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |
Referencias
- Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. ....
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Reimpresiones y permisos
