Hemos logrado establecer un método para el aislamiento de ARN a partir de semillas de plantas que contienen grandes cantidades de aceites, proteínas y polifenoles, que tienen efectos inhibidores sobre el aislamiento de ARN de alta pureza. Nuestro método es adecuado para monitorear la expresión de genes con transcripciones de bajo nivel en semillas.
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Artículo de método
Un método eficiente para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas para uso en el Análisis Cuantitativo de transcriptoma
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Resumen
Resumen
Las semillas de plantas acumulan grandes cantidades de reservas de almacenamiento que comprenden materia orgánica biodegradable. Los seres humanos dependen de las reservas de almacenamiento de semillas para alimentos y como materiales industriales. Los perfiles de expresión génica son herramientas poderosas para investigar la regulación metabólica en las células vegetales. Por lo tanto, se requieren perfiles de expresión génica detallados y precisos durante el desarrollo de semillas para el mejoramiento de cultivos. La adquisición de ARN altamente purificado es esencial para producir estos perfiles. Se necesitan métodos eficientes para aislar el ARN altamente purificado de las semillas. Aquí, describimos un método para aislar ARN de semillas que contienen grandes cantidades de aceites, proteínas y polifenoles, que tienen efectos inhibidores en el aislamiento de ARN de alta pureza. Nuestro método permite obtener ARN altamente purificado a partir de semillas sin el uso de fenol, cloroformo o procesos adicionales para la purificación del ARN. Este método es aplicable a las semillas de Arabidopsis, colza y soja. Nuestro método será útil para monitorear los patrones de expresión de transcripciones de bajo nivel en semillas maduras y en desarrollo.
Introducción
Las plantas producen semillas, que dan lugar a la generación siguiente. Las semillas se acumulan grandes cantidades de reservas de almacenamiento, tales como aceites, hidratos de carbono y proteínas, para el crecimiento post-germinativa. Los seres humanos utilizan las reservas de almacenamiento de las semillas como fuentes de alimentación humana y animal, y por lo tanto las semillas de plantas son uno de los principales proveedores de materia orgánica comestible en todo el mundo. El aumento de los rendimientos de semilla es un reto importante en la ciencia de las plantas.
Dado que las reservas de almacenamiento de semillas son fuentes de ....
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Protocolo
1. Extracción de ARN total de semillas de la planta
- Preparar conjuntos de tampones, columnas giratorias, 1.5 y 2.0 mL tubos de polipropileno, y tubos de polipropileno de 1,5 ml sin nucleasa.
- Añadir 1% (w / v) de polivinilpirrolidona de calidad para biología molecular (en lo sucesivo denominado PVP) a la celda tampón de lisis para la extracción de RNA y agitar vigorosamente. Incubar durante 20 min a 25 ° C para disolver completamente. Después de 20 min de incubación, mezclar el tampón suavemente girando el tubo boca abajo para evitar la formación de burbujas. Almacenar a temperatura ambiente (15-25 ° C) antes de su uso.
- La cosecha de fru....
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Resultados
En primer lugar, se investigó la concentración óptima de PVP usando Arabidopsis semillas maduras. ARN total fue aislado de aproximadamente 1000 semillas de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente, utilizando tampón de lisis celular que contiene 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% o 2,0% de PVP. Después de la homogeneización y centrifugación, se recogió el sobrenadante evitando al mismo tiempo la capa de aceite y los residuos de la semilla (Figura 1A).
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Discusión
los perfiles de expresión de genes contribuyen a nuestra comprensión de la fisiología de las plantas; Por lo tanto, los métodos de aislamiento de ARN específico se han desarrollado para cada condición de muestra 9-12. Se investigaron los procesos que se inhibe durante el aislamiento de ARN a partir de semillas y se ha encontrado que el ARN a membranas de sílice fue gravemente inhibida. Grandes cantidades de petróleo, proteínas y polifenoles inhiben el aislamiento de ARN. Hemos modificado el proceso de extracc.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al personal de la genómica funcional y Facility Fondo para espectrografía y Bioimagen, Nibb instalaciones centrales de la investigación y en un Centro de Investigación de Plantas Modelo, Nibb bio-Center.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polivinilpirrolidona | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENEIZADOR S-303 | COMO UNO | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT Kit de reactivos (perfecto en tiempo real) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Kit de qPCR rápido | Kapa biosystems | KK4601 |
Referencias
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J.
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Reimpresiones y permisos
