Imágenes en vivo para el Estudio de la inestabilidad dinámica de microtúbulos en los cánceres de mama resistentes a taxano

Summary

En este artículo, presentamos un protocolo que describe un método in vivo para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos en células de cáncer de mama resistentes a docetaxel (MCF-7_TXT). En este método, se utiliza un sistema de imágenes de microscopía de deconvolución para detectar la expresión de GFP-tubulina en las células diana.

Abstract

Los taxanos como el docetaxel pertenecen a un grupo de agentes dirigidos a los microtúbulos (MTA) en los que se confía comúnmente para tratar el cáncer. Sin embargo, la resistencia a los taxanos en las células cancerosas reduce drásticamente la eficacia del uso a largo plazo de los fármacos. La evidencia acumulada sugiere que los mecanismos subyacentes a la resistencia a los taxanos incluyen tanto mecanismos generales, como el desarrollo de resistencia a múltiples fármacos debido a la sobreexpresión de proteínas de eflujo de fármacos, como mecanismos específicos de taxanos, como los que involucran la dinámica de los microtúbulos.

Debido a que los taxanos se dirigen a los microtúbulos celulares, medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos es un paso importante para determinar los mecanismos de resistencia a los taxanos y proporciona información sobre cómo superar esta resistencia. En el experimento, se utilizó un método in vivo para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos. La α-tubulina marcada con GFP se expresó e incorporó a los microtúbulos en las células MCF-7, lo que permitió el registro de la dinámica de los microtúbulos mediante un lapso de tiempo utilizando una cámara sensible. Los resultados mostraron que, a diferencia de las células MCF-7_CC parentales no resistentes, la dinámica de los microtúbulos de las células_TXT MCF-7 resistentes a docetaxel es insensible al tratamiento con docetaxel, lo que causa la resistencia a la detención mitótica y la apoptosis inducidas por docetaxel. Este artículo describirá este método in vivo para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos.

Introduction

La causa principal de la mortalidad del cáncer de mama es a través de la metástasis ^{1, 2.} Los taxanos, tales como docetaxel y paclitaxel, se utilizan actualmente como regímenes de primera línea en el tratamiento de cáncer de mama metastásico ^{2, 3, 4, 5, 6.} Son parte de un grupo de agentes de microtúbulos orientación (MTA) que interrumpen la dinámica de los microtúbulos. Sin embargo, uno de los mayores desafíos para el uso de taxanos en el tra....

Protocol

1. Preparación de las células de imágenes en vivo

1. Cultivo de células y la siembra
   1. Utilice células MCF-7 de cáncer de mama seleccionados para la resistencia a docetaxel (MCF-7 _TXT) y su línea celular parental no resistentes (MCF-7 _CC). El proceso de selección detallada y la caracterización de estas líneas celulares seleccionadas se han descrito anteriormente ^24.
   2. Crecer todas las células en placas de cultivo de 10 cm a 37 ° C en un medio compuesto 90% de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y 10% de suero bovino fetal (FBS) y suplementado con aminoácidos no esenciales.....

Results

Utilizando el protocolo presentado aquí, se estudiaron los efectos de docetaxel en la dinámica de los microtúbulos de normal (MCF-7 _CC) y docetaxel resistentes (MCF-7 _TXT) las células de cáncer de mama. Dos conjuntos de imágenes muestran los efectos de docetaxel (0,5 M) en el crecimiento de los microtúbulos y la manteca en MCF-7 _CC y MCF-7 _TXT células (Figura 1A).

Ta.......

Discussion

Hay dos métodos principales para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos in vitro y en vivo. En el método in vitro, la tubulina purificada se utiliza para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos con lapso de tiempo diferencial de interferencia de microscopía de contraste mejorado por computadora. En el método in vivo, microinyectó tubulina fluorescente, o se expresa GFP-tubulina, se incorpora en los microtúbulos. La dinámica (crecimiento y acortamiento) de los .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Aminoácidos no esenciales	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM fenol sin rojo	Gibco, Invitrogen	21063
Reactivo CellLight *BacMam 2.0* GFP-tubulina	ThermoFisher Scientific	C10613	Reactivo clave para expresar tubulina GFP en células
Reactivo CellLight *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Control
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	para la deshidratación de decetaxel
Vidrio de 22 mm	Coveslip Fisher Scientifics	12-545-101
Placa de cultivo de 6 pocillos	Greiner Bio-One International		cultivo Celi de 6 pocillos
DeltaVision Sistemas de imágenes de microscopía	GE Health		Este sistema está equipado con una estación meteorológica para controlar la temperatura y el CO2. También está equipado con el software Worx para la deconvolución y el control de lapso de tiempo.
Tripsina-EDTA (0,25 %), rojo de fenol		ThermoFisher Scientific
Bright-line, Hausser Scientific	Hausser Scientific, distribuido por VWR	Nº de proveedor: 1492 Nº VWR:15170-172