Murino de trasplante de todo el espesor de la piel es un modelo bien establecido para estudiar el rechazo en un entorno aloinmune. A continuación, ofrecemos un tutorial de cada paso que participan en la realización de un c BALB / -> C57BL 6 trasplante de piel / de espesor total.
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Artículo de método
Murino de grosor completo Trasplante de Piel
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Resumen
Resumen
Murino de trasplante de todo el espesor de la piel es un modelo in vivo bien establecido para estudiar la respuesta aloinmune y rechazo del trasplante. A pesar de su aplicación limitada a los seres humanos, el trasplante de piel en ratones ha sido ampliamente empleado para la investigación del trasplante. El procedimiento es fácil de aprender y realizar, y que no requiere técnicas de microcirugía delicada ni una amplia formación. Además, el rechazo del injerto en este modelo se produce en una reacción inmunológica muy reproducible y se monitoriza fácilmente mediante la inspección directa y palpación. Además, el trasplante de piel secundaria con injertos de donantes emparejados o de la piel de otro fabricante puede llevar a cabo en modelos de trasplante más complejos como un método alternativo y sin complicaciones para evaluar la tolerancia específica del donante. Las complicaciones son bajos y son, en general, limitada a una sobredosis de anestesia o dificultad respiratoria después del procedimiento. El fracaso del injerto, por el contrario, se produce habitualmente como resultado de una mala preparación de la grpopa, posicionamiento incorrecto en el lecho del injerto, o la colocación inadecuada de la venda. En este artículo, se presenta un protocolo para el trasplante de piel de espesor completo en ratones y describimos los pasos son importantes y necesarias para el éxito del procedimiento.
Introducción
El trasplante de órganos es el tratamiento de elección para pacientes con insuficiencia orgánica terminal, y los resultados han mejorado notablemente con los avances en procedimientos quirúrgicos y protocolos de inmunosupresión. Sin embargo, la inmunosupresión a largo plazo se asocia con efectos secundarios significativos, y el desarrollo de nuevas estrategias que promueven la tolerancia sigue siendo el objetivo de la investigación trasplante moderna.
Numerosos modelos animales se han desarrollado para la investigación básica en el trasplante, para el estudio de los mecanismos de rechazo de aloinjertos y para poner a prueba la inmunosupresión se aproxima a la prevención del rechazo del injerto y para promover la tolerancia a largo plazo 1-3. Los modelos de ratón han convertido en el pilar de la investigación inmunológica debido a la disponibilidad exclusiva y extensa de anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico y cepas puras y transgénicos bien definidos. El trasplante de piel es un procedimiento simple que no requiere conocimientos especiales de microcirugía y puedemonitorizar fácilmente después de la operación. En conjunto, el trasplante de piel de ratón ha sido una herramienta excepcional para estudiar muchos aspectos implicados en la respuesta aloinmune, incluyendo la entrega de antígeno, el tráfico de células y la destrucción del tejido durante el rechazo de injerto 4,5.
Aquí, se muestra el procedimiento paso a paso para el trasplante de piel de espesor total usando el modelo de ratón, y se describen los pasos son importantes y necesarias para un éxito del injerto de la piel trasplantada.
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Protocolo
Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité de la Universidad Johns Hopkins y Uso Animal Care (JHUACUC). Los procedimientos específicos se realizaron bajo la MO13M292 protocolos ACUC aprobado y MO13M370.
1. Donantes de la cosecha de la piel
- Anestesiar el ratón donante con isoflurano (vaporizador de inducción en el 4%, el mantenimiento con un 1 - 2% a través del cono del ratón). Utilice el dedo del pie retirada pizca reflejo para controlar la profundidad de la anestesia.
- El uso de una máquina de afeitar eléctrica, afeitarse la parte posterior del animal y desinfectar con 10% de yodo de povidona (por ejemplo, Betadine).
- Con unas tijeras estériles, guantes y una técnica aséptica, piel de la espalda de los donantes de la cosecha desde la cadera hasta el cuello, con disección roma a nivel del tejido conjuntivo laxo.
- La eutanasia a los animales por dislocación cervical después de cosechar elinjerto de piel.
- Bajo el microscopio, separar el tejido conjuntivo, tejido graso, y panículo carnoso de la piel de la espalda con unas tijeras finas tenotomía. El panículo carnoso es un músculo delgado, transparente responsable de los movimientos espasmódicos de la piel.
- Utilizando una técnica estéril instrumentos, cortar los injertos de 15 mm x 15 mm de la piel de la espalda para una de 10 mm x 10 mm a 15 mm x 15 mm lecho del injerto.
- Guarde los injertos sobre gasas empapadas con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en una placa de Petri en hielo.
NOTA: 8 - 10 injertos se puede obtener de un ratón donante.
2. receptor de trasplante de piel
- Anestesiar al ratón receptor con isoflurano (vaporizador inducción a 4%, el mantenimiento con un 1 - 2% a través del cono del ratón). Utilice el dedo del pie retirada pizca reflejo para controlar la profundidad de la anestesia.
- Administrar 0,02 mg / kg de peso corporal de buprenorfina para el alivio del dolor postoperatorio.
- Afeitar el lado de la espalda del animal en el que el wi injertoll ser insertada y desinfectar con povidona yodada al 10%.
- Con unas tijeras, corte a 10 mm x 10 mm a 15 mm x 15 mm cuadrado de piel. El tamaño del defecto debe ser ligeramente mayor (10%) que el injerto. Cortar tan superficialmente como sea posible. Tenga cuidado de preservar el panículo carnoso y vasos. El panículo carnoso puede ser distinguida de la fascia subyacente por su movilidad y los vasos sanguíneos que se ejecutan superficial a ella.
- Coloque el injerto en el lecho del injerto, evitando pliegues a lo largo de los bordes.
- Coloque 8 puntos de sutura en las esquinas y en el centro de cada borde. Para cada sutura, pasar la aguja a través del injerto y luego a través del panículo carnoso del injerto cama debajo de la piel destinatario circundante.
- Retire la máscara anestésica y dejar que el animal se recupere de la anestesia parcialmente antes de aplicar el vendaje adhesivo.
- Envolver el ratón receptor con una venda adhesiva con una gasa doblada sobre el injerto. Hacer el vendaje mediante la combinación de dos vendajes, cortandola parte adhesiva de una y la colocación de las dos almohadillas absorbentes juntos.
- Vigilar estrechamente el ratón durante la recuperación para asegurar que el vendaje no está restringiendo la excursión del tórax y la respiración. Quitar el vendaje si el ritmo respiratorio disminuye o el animal empieza a jadear o respirar superficialmente.
3. Cuidado posoperatorio
- Administrar enrofloxacina 5 mg / kg después de la cirugía para la profilaxis de infección.
- Coloque el ratón trasplantado en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica para microondas hasta que se recupere completamente de la anestesia.
- Observar el ratón durante 1 hora después de la operación antes de devolverlo a la instalación de la vivienda.
- Siete días después de la cirugía, anestesiar el ratón como en el paso 2.1. Retire el vendaje cortando sólo a través de la parte ventral de la venda.
- Observar y palpar el injerto al día siguiente en busca de signos de formación de costras, la contracción, o dureza. Si está presente, el injerto puede no haber logrado vasculariza adecuadación y debe ser considerado como un fallo técnico.
- Supervisar diariamente para detectar signos de rechazo. Considere injertos rechazado cuando ≥90% del tejido de injerto se vuelve necrótico.
- La eutanasia a los animales rechazados y les cosechar para su análisis.
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Resultados
La colocación del vendaje en el ratón receptor es un paso importante del procedimiento. El injerto de piel se coloca en el tronco receptor, entre el hombro, cadera y columna vertebral (Figura 1). El vendaje se hace con una gasa plegada y la combinación de dos vendas adhesivas de plástico. El ratón receptor se coloca con el injerto hacia abajo sobre la gasa en el centro de la venda. El uso de dos pinzas de micro curvas, el extremo inferior del vendaje se tira primero, y l...
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Discusión
Desde su introducción por Medawar, primero en estudios humanos y luego en conejos y ratones, el trasplante de piel ha sido un modelo inestimable para el estudio de las respuestas inmunes alogénicas 6,7. En este manuscrito, se presenta un modelo de gran escala, no vascularizado, el trasplante de piel de grosor usando de nuevo la piel superior e inferior. Varios métodos alternativos, incluyendo el uso de la piel de la cola o piel de la oreja del ratón como fuente de tejido de injerto, se ha informado hasta la f...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R01AI077610.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Micropinzas rectas | Sigma | F4017 | |
| Micropinzas curvas | Aesculap | BD333R | |
| Tijeras de tenotomía Stevens curvas | Aesculap | BC905R | |
| Tijeras de disección Mayo Sigma | S3146 | ||
| Micro portaagujas | Aesculap | BM563R | |
| Gasa estéril | Covidien | ||
| 6-0 Sutura de nylon | MWI | 31849 | |
| Banda de tiras de plástico- Ayuda | Johnson & Johnson | Obtenido de la farmacia | |
| 10 cm Placa de Petri | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Calidad Biológica 119069131 | ||
| Buprenorfina | Número DEA requerido; Obtenido de la farmacia del hospital | ||
| Enrofloxacina | Bayer Health Care | 186599 |
Referencias
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- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753(2014).
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Reimpresiones y permisos
