Determinación de todo el genoma de los mamíferos sincronización de replicación de ADN por medición del contenido

Resumen

Describimos aquí un enfoque relativamente rápido y simple para mapear el tiempo de replicación de todo el genoma de los mamíferos, desde el aislamiento celular hasta el análisis básico de los resultados de la secuenciación. Se proporcionará un mapa genómico de un programa de replicación representativo siguiendo el protocolo.

Resumen

La replicación del genoma se produce durante la fase S del ciclo celular en un proceso altamente regulado que asegura la fidelidad de la duplicación del ADN. Cada región genómica se replica en un momento distinto durante la fase S a través de la activación simultánea de múltiples orígenes de replicación. Tiempo de replicación (TdR) se correlaciona con muchas características genómicas y epigenéticos y está vinculada a las tasas de mutación y cáncer. La comprensión de la vista genómico completo del programa de réplica, en la salud y la enfermedad es un importante objetivo futuro y desafío.

En este artículo se describe en detalle la "Relación de número de copia S / G1 para el mapeo genómico Tiempo de replicación" método (denominado en el presente documento: CNR-TdR), un enfoque simple para mapear el genoma amplia TdR de células de mamíferos. El método se basa en las diferencias de número de copias entre las células de fase S y las células en fase G1. El método CNR-TdR se lleva a cabo en 6 pasos: 1. Preparación de las células y la tinción con yoduro de propidio (PI); 2. Sorting G1 y células en fase S utilizando células activadas por fluorescencia (FACS); 3. purificación de ADN; 4. La sonicación; 5. Preparación y secuenciación Biblioteca; y 6. El análisis bioinformático. El método CNR-TdR es un método rápido y fácil que resulta en mapas detallados de replicación.

Introducción

la replicación del ADN de los mamíferos está estrechamente regulada para asegurar la replicación precisa de cada cromosoma exactamente una vez durante el ciclo celular. La replicación se realiza de acuerdo con un orden altamente regulado - varias grandes regiones genómicas (~ Mb) se replican en el inicio de la fase S (a principios de replicar dominios), mientras que otras regiones genómicas replican luego en (dominios medias y replicar tarde) medio o fase S tardía ^1. La mayor parte del genoma se replica al mismo tiempo en todos los tejidos (dominios TdR constitutivo), mientras que 30% - 50% del genoma, cambia su TdR entre los tejidos

Protocolo

Nota: TdR se puede medir sólo en cultivo, las células no sincronizadas. El procedimiento debe comenzar con al menos 1 - 2 x 10 ⁶ células de crecimiento rápido, que dará lugar generalmente a ~ 1 x 10 ⁵ células en fase S (el paso limitante de la velocidad). Se recomienda llevar a cabo cada experimento usando dos o tres repeticiones. Todo el proceso de CNR-TdR se puede completar en una semana - dos días deben estar dedicados a todos los pasos hasta la preparación de la biblioteca, se necesitan uno o dos días para la secuenciación y es necesario un día adicional para el análisis de datos inicial.

1. Recolección de células ....

Resultados

Un mapa típico TdR se muestra en la Figura 3 para los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). Esta figura demuestra el proceso de análisis, ya que muestra tanto los puntos, que son la razón normalizada / G1 S para las ventanas individuales (paso 8.3), así como la línea que resulta de la suavización cúbico y la interpolación (paso 8.5).

Tales mapas capturan la organización del programa de replicación, que es.......

Discusión

CNR-TdR se puede realizar, en principio, en cualquier población de células en proliferación eucariota que puede ser dividido por FACS a S y fases G1 (revisado por Rhind N. y Gilbert DM ^20). El método descrito aquí se ha ajustado a células de mamífero con un tamaño de genoma de ~ 3 Gb tales como humanos y de ratón. se necesitan pequeños cambios en el protocolo CNR-TdR (en preparación de células y la profundidad de secuenciación), con el fin de ajustarla a otros eucariotas. Se debe prestar atención.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PBS	BI (Industrias Biológicas)	02-023-1A
Tripsina-EDTA	BI (Industrias Biológicas)	03-052-1B
Tubo cónico de 15 mL	Corning	430790
5 mL Tubo de poliestireno redondo con tapa de filtro de celdas	BD-Falcon	352235
Etanol	Gadot	64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL	Sigma	R4875
Yoduro de propidiomo 1 mg/mL	Sigma	P4170
Parafilm	Parafilm	PM-996
1,5 mL DNA LoBind Tubos Eppendorf	Eppendorf	22431021
BSA	Sigma	A7906
1,7 mL MaxyTubo transparente	Perlas magnéticas Axygen	MCT-175-C
- Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Ultrasonicador	Covaris	M-series  -530092
50 µ L microTUBE AFA Tapón de rosca de fibra 6 x 16 mm	Covaris	520096
Qubit fluorímetro	Invitrogen
		Q32854
Electroforesis 2200 Sistema de estación de cinta	Agilent	D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Illumina Sistema NextSeq	Illumina	SY-415-1001
Kit Dneasy para la purificación de ADN	Qiagen	69504
PureProteom Soporte magnético	Millipore	LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC	DAKO	F7210
FACS clasificador	BD	FACSARIA III
FACS BD		FACSDiva v 8.0.1

Qubit dsDNA Kit de ensayo de alta sensibilidad (HS) Invitrogen