Un sensor basado en aptámero para no quelado de gadolinio (III)

Resumen

Se describe el uso de moléculas de polidesoxinucleótidos (aptámero de 44 meros) para detectar iones de gadolinio (III) no quelados en una solución acuosa. La presencia del ion se detecta a través de un aumento en la emisión de fluorescencia del sensor.

Resumen

Se demuestra un método para determinar la presencia de ion gadolinio trivalente no quelado (Gd³⁺) en solución acuosa. Gd³⁺ a menudo está presente en muestras de agentes de contraste a base de gadolinio como resultado de reacciones incompletas entre el ligando y el ion, o como un producto de disociación. Dado que el ion es tóxico, su detección es de vital importancia. En este trabajo, se describe el diseño y el uso de un sensor basado en aptámero (sensor Gd) para Gd³⁺. El sensor produce un cambio de fluorescencia en respuesta al aumento de las concentraciones del ion y tiene un límite de detección en el rango nanomolar (~100 nM con una relación señal-ruido de 3). El ensayo puede ejecutarse en un tampón acuoso a pH ambiente (~7 - 7,4) en una microplaca de 384 pocillos. El sensor es relativamente poco reactivo hacia otros iones metálicos fisiológicamente relevantes, como los iones de sodio, potasio y calcio, aunque no es específico para Gd³⁺ sobre otros lantánidos trivalentes como el europio (III) y el terbio (III). Sin embargo, los lantánidos no se encuentran comúnmente en los agentes de contraste o en los sistemas biológicos, por lo que el sensor puede usarse para determinar selectivamente Gd³⁺ no quelado en condiciones acuosas.

Introducción

La creciente importancia de la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) en el diagnóstico clínico, que está limitado por la sensibilidad inherente de la técnica, ha dado como resultado el rápido crecimiento de la investigación en el desarrollo de nuevos agentes de contraste a base de gadolinio (GBCAs) ^1. GBCAs son moléculas que se administran para mejorar la calidad de la imagen, y por lo general tienen la estructura química de un ion trivalente de gadolinio (Gd ³⁺⁾ coordinado a un ligando polidentado. Esta formación de complejos es de importancia crítica que no quelado Gd ³⁺ es tóxico; se ha implicado en el desarrollo de ....

Protocolo

NOTA: agua de calidad de biología molecular se utiliza en todas las preparaciones de tampón y de solución. Todos los tubos de microcentrífuga desechables (y PCR) y puntas de pipeta son DNasa y RNasa libre. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) para todos los productos químicos antes de su uso. Se recomienda el uso de equipo de protección personal (EPP) apropiado.

1. Preparación de los aptámeros de archivo Soluciones

1. Compra 2 hebras de polidesoxinucleótido comercialmente. Ordenar ambas cadenas con la purificación mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
   MODALIDAD 1 (Gd-aptám....

Resultados

Un cambio de fluorescencia típico de la solución de Gd-sensor en presencia de no quelado Gd ³⁺ se muestra en la Figura 2. La emisión puede ser trazado como el pliegue del cambio de fluorescencia (Figura 2A) o de la lectura de fluorescencia en bruto (Figura 2B) en unidades arbitrarias (AFU). Ambas parcelas producen curvas de calibración muy similares con un rango lineal para las concentraciones de Gd ³⁺ por debajo de.......

Discusión

Usando el Gd-sensor basado en aptámero, un aumento en la emisión de fluorescencia que es proporcional a la concentración de Gd no quelado ³⁺ se observa. Para minimizar la cantidad de muestra utilizada, el ensayo se puede ejecutar en una microplaca de 384 pocillos con un volumen total de la muestra de 45 l por pocillo. En este diseño, la elección de fluoresceína (FAM) y DABCYL (Dab) se basa principalmente en el coste de los reactivos; para modificar la longitud de onda de emisión, una pareja diferente de fluor.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Gd-aptámero	IDTDNA	Secuencia de entrada y modificación del fluoróforo en la forma de pedido	Se puede utilizar un fluoróforo con una longitud de onda de emisión diferente. El aptámero también se puede pedir a otra empresa.
Filamento de enfriamiento	IDTDNA	Secuencia de entrada y modificación del enfriador en la forma de pedido	Se puede utilizar un enfriador diferente para una transferencia de energía óptima desde el fluoróforo. El aptámero también se puede pedir a otra empresa.
		de grado de biología molecular	Ningún fabricante específico, tanto con DEPC como sin DEPC funcionan igual
de bien Cloruro de gadolinio (III) anhidro	Strem	936416
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Cloruro de magnesio anhidro	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Cloruro de sodio	Acros Organics
Cloruro de potasio	Fisher Scientific	P333-500
Hidróxido de sodio, pellets	Fisher Scientific	BP359
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	SA49	Tóxico y corrosivo
Placas de poliestireno NBS de fondo plano negro de brida baja de 384 pocillos	Placas Corning	3575	que son adecuadas para fluorescencia lectura.
Filtro estéril desechable para biberones Nalgene Rapid-Flow	Thermo Scientific	5680020	La tapa de la botella está equipada con una membrana PES de 0,2 micras
Frascos estériles desechables de 250 ml	430281	Corning Se puede utilizar un frasco más grande o más pequeño
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Sin			fabricante específico, siempre que estén libres de ADNasa y ARNasa
Tubos de PCR de			0,2 mLNingún fabricante específico, siempre que estén libres de ADNasa y ARNasa
Micropipetas			Ningún fabricante específico
Puntas de pipeta (sin filtro) de tamaños apropiados			Ningún fabricante específico, siempre que estén libres de ADNasa y ARNasa
EquipmentLector de
placas	Biotek Synergy H1		Los lectores de placas de otros fabricantes funcionarían igual de bien

Agua tóxicos 327300025 corrosivo