ويصف المقال طريقة تزيد من الإنتاجية في حين موازنة الجهد والدقة لاستخراج الدهون من أغشية الخلايا من الكائنات الحية الدقيقة لاستخدامها في توصيف كل من الدهون الكلية والوفرة النسبية للدهون مؤشر لتحديد بنية المجتمع الميكروبية التربة في الدراسات مع العديد من العينات.
وتعتبر المجتمعات الميكروبية من العوامل المهمة والمنظمين لعمليات النظم الإيكولوجية. لفهم كيفية إدارة النظم الإيكولوجية قد تؤثر على المجتمعات الميكروبية، وتقنية دقيقة نسبيا ولكن جهد كثيف لتقليل تكوين المجتمع الميكروبي هو تحليل الأحماض الدهنية الفوسفورية (بلفا). وقد وضعت بلفا لتحليل المؤشرات الحيوية الفوسفورية، والتي يمكن استخدامها كمؤشرات للكتلة الحيوية الميكروبية وتكوين مجموعات وظيفية واسعة من الفطريات والبكتيريا. وقد استخدمت عادة لمقارنة التربة تحت المجتمعات النباتية البديلة، والبيئة، ونظم الإدارة. وقد تبين أن طريقة بفا حساسة للكشف عن التحولات في تكوين المجتمع الميكروبي.
وقد تم تطوير طريقة بديلة، واستخلاص واستخلاص ميثيل الأحماض الدهنية (ميدي-فا) للاستخراج السريع من الدهون الكلية، دون فصل جزء الفوسفورية، من الثقافات الخالصة ك تقنية تحديد الميكروبية. هذه الطريقة هيسريع ولكن أقل ملاءمة لعينات التربة لأنها تفتقر إلى خطوة أولية تفصل جزيئات التربة وتبدأ بدلا من ذلك مع رد فعل التصبن التي من المرجح أن تنتج التحف من المادة العضوية الأساسية في التربة.
توضح هذه المقالة الطريقة التي تزيد الإنتاجية بينما موازنة الجهد والدقة لاستخراج الدهون من أغشية الخلايا من الكائنات الحية الدقيقة لاستخدامها في توصيف كل من الدهون الكلية والوفرة النسبية للدهون مؤشر لتحديد بنية المجتمع الميكروبية التربة في الدراسات مع العديد من العينات. الطريقة تجمع بين الدقة التي تحققت من خلال التنميط بلفا عن طريق استخراج وتركيز الدهون في التربة كخطوة أولى، والحد من الجهد من خلال سابونيفينغ المواد العضوية المستخرجة ومعالجة مع طريقة ميدي-فا كخطوة ثانية.
ونظرا للدور الرئيسي للكائنات المجهرية في دورة المغذيات 1 ، وتعديل تكوين المجتمع النباتي 2 ، وتنظيم إنتاجية النبات 3 ، وتحلل المادة العضوية 4 ، فهم المجتمعات الميكروبية للتربة أمر حيوي لفهم النظم الإيكولوجية الأرضية.
وبسبب وفرة عالية نسبيا في التربة، وتوقيعها الكيميائي، يمكن استخدام المؤشرات الحيوية للدهون لتعريف المجموعات الإيكولوجية المهيمنة التي تضم المجتمعات الميكروبية للتربة 5 . من خلال تحديد المؤشرات الحيوية للدهون التي هي سمة من مجموعات الميكروبات المختلفة، يمكننا تقدير الدهون الكلية، ومن ثم فصل هذه الدهون في المجموعات ذات الصلة إيكولوجيا مثل الجرام إيجابية (غم +) والبكتيريا السالبة الغرام (غم)، الفطريات الفطرية (آم) و سابروتروفيك الفطريات، و أكتينوميستس 5 ، سس = "كريف"> 6 ، 7 ، 8 .
هناك العديد من الطرق لتوصيف جوانب المجتمعات الميكروبية. طريقة بلفا هي واحدة تستخدم عادة لفهم بنية المجتمع الميكروبية الأساسية. بل هو وسيلة فعالة لتقييم وفرة النسبية من المجموعات الميكروبية وكذلك الكتلة الحيوية الميكروبية الكلية. بسبب دوران الدهون السريع، كما يسمح التنميط بلفا نسبيا الكشف السريع للتغيرات في المجتمع الميكروبي التربة ويعطي المعلومات التي تسمح المقارنة بين وظيفة النظام الإيكولوجي، على سبيل المثال، الفطرية: نسب البكتيريا لتقييم معدلات الدراجات المغذية 1 ، 9 ، 10 . ومع ذلك، في حين أن طريقة استخراج بلفا هي وقت تكريم ويحظى باحترام جيد، بل هو أيضا مضيعة للوقت ولا يفي جيدا لدراسات على نطاق النظام الإيكولوجي التي تتطلب عددا كبيرا من العينات من نطاق مكرراتf "> 11 ، 12 .
في المقابل، فإن طريقة استخراج استر الميثيل الأحماض الدهنية (ميدي-فا) لديه القدرة على السماح الإنتاجية السريعة. في هذه الطريقة، يتم سابونيفيد العينات، وتحويلها إلى فام، المستخرجة، ومن ثم تحليلها. طريقة ميدي-فا سريعة ولكن أقل تمييزا من بلفا، الذي يجمع بين استخراج الدهون مع فصل فئات الدهون المختلفة 13 (الدهون الفوسفاتية، الدهون المحايدة، والسكرية).
في هذا البروتوكول، ونحن تصف الطريقة التي تجمع بين عناصر كل من بلفا و ميدي-فا التنميط الدهون. فإنه يستخدم استخراج الدهون باستخدام الخطوات الأولية استخراج الكلوروفورم من طريقة بلي و ديير المعدلة، ومن ثم التصبن والتحويل إلى فامس. وهذا يوفر وسيلة قوية للكشف عن هيكل المجتمع الميكروبي مع استبعاد الكثير من الضوضاء الخلفية من المواد غير الميكروبية 5 ، 14 </suص>. وقد تم تطوير هذه الطريقة لتحقيق التوازن بين كل من بلفا و ميدي-فا البروتوكولات، أي الاحتفاظ بالجزء الأكبر من الدقة مع زيادة الإنتاجية لجعلها لوجستية واقتصادية مجدية لتحليل الدهون من الدراسات واسعة النطاق مع العديد من العينات 15 . من خلال إجراء استخراج الأولي وعزل المكونات القابلة للذوبان العضوية ( مثل الدهون) قبل أداء ميدي-فا، واستكمال هذا مع خطوة تنقية، بروتوكول يوفر التوازن بين السرعة والدقة.
لفحص عينات متعددة من التجارب مع العديد من مكررات و / أو وحدات تجريبية، قد يجد الباحثون تحليل الدهون الدهنية الفوسفورية (بلفا) لتكون باهظة من حيث الوقت والمواد 25 . مع طريقة بلفا، يتم استخراج فوسفوليبيدس غشاء الخلية، وتنقيته، وتحديدها باستخدام تعديل بل و ديير 26 ثنائي الطور استخراج المائي العضوي. ويلي ذلك مرحلة الكروماتوجرافيا السيليكا الصلبة المرحلة لفصل الدهون عن طريق قطبية، ومثيلة القلوية من الأحماض الدهنية الفوسفاتية في استرات الميثيل الأحماض الدهنية. في بلفا التنميط العائد الدهون يمكن أن تكون منخفضة ولكن من نقاء عالية جدا. أدخلت هوية الميكروبية طريقة بديلة، الإجراء الأحماض الدهنية ميثيل استر (ميدي-فا). في طريقة ميدي-فا، يتم استخراج جميع الدهون مباشرة من الثقافات النقية أو التربة / الرواسب عينات 11 ، 12 ، 27 من خلالالتصبين. هذه الطريقة لديها فقدان الدهون أقل وسريع لأنه ليس لديه أي من تركيز أو تنقية الخطوات من طريقة بلفا. ومع ذلك، في حين أن طريقة ميدي-فا سريعة وأقل تكلفة، لأنه كان مصمم أصلا لتحديد الكائنات الحية في الثقافة الخالصة، لا توجد خطوات أولية استخراج أو تنقية. وهكذا، يمكن أن تشمل مركبات تشبه الدهون تشترك في استخراجها من المادة العضوية في التربة التي تشوه توقيع المجتمع 27 ، 28 ، 29 . لأن هذا الإدراج يمكن أيضا تشويه التدابير الكتلة الحيوية، وعادة ما تستخدم ميدي-فا فقط لوصف نوعيا الخشنة الدهون في التربة 13 .
الإجراء الذي وصفنا هنا يجمع بين أفضل من اثنين من إجراءات استخراج منفصلة: 1) استخراج وتركيز الدهون باستخدام طريقة بلي و داير 26 المعدلة، و 2) حمض الدهني ميثيل استر سابونيفيكاتيون، المثيلة، واستخراج، وإجراءات غسل قاعدة وضعت تجاريا. وقد تم تطوير هذه الطريقة لتحقيق فوائد كل من هذه البروتوكولات مع التقليل من عيوب 15 . من خلال إجراء استخراج الأولي وعزل المكونات القابلة للذوبان العضوية ( مثل الدهون) قبل أداء ميدي-فا، واستكمال هذا مع خطوة تنقية، ويوفر هذا البروتوكول التوازن بين السرعة والدقة. على الرغم من أن هذه الطريقة قد لا تكون مناسبة عند الحاجة إلى نقاء عالية ( أي لتحليل 13 C بلفا) أو عند تحليل الدهون الفوسفاتية والدهون المحايدة بشكل منفصل، في كثير من الحالات فإنه يسمح للكشف عن استجابات المجتمع الميكروبي للظروف البيئية مع حساسية أكبر من الحمض النووي القائم الأساليب 30 ، 31 ، 32 ، 33 . تتحلل الدهون الغشائية بسرعة بعد موت الخلايا مما يسمح لهمتعكس المجتمع الميكروبي الحية في وقت أخذ العينات 5 ، 7 ، على النقيض من الحمض النووي البيئي التي يأتي الكثير من المعلومات من الكائنات الميتة أو غير النشطة 34 . وبالنظر إلى ارتفاع معدل السكون لوحظ بين الكائنات الحية الدقيقة التربة 35 ، توصيف الكتلة الحيوية الحية يمكن استخدامها لفهم التفاعلات الزئبق النباتي الزماني على نطاق زمني غرامة نسبيا ويمكن استخدام المؤشرات الحيوية للدهون لفحص الحالة الفسيولوجية للمجتمع الميكروبية 7 . وقد تبين أن هناك حاجة إلى أساليب الإنتاجية العالية لتقييم الاستجابة الميكروبية في إعدادات حقل كبير 25 ، وبينما الطريقة التي نقترح هنا لا تكرار دقة بلفا العلامات البيولوجية التنميط، فإنه يزيد الإنتاجية مع التقليل من التقلب أدركت مع ميدي-فا إجراء. وقد أثبتت هذه الطريقة أن تكون أداة فعالة في معالجةالمسائل المتعلقة بديناميات المجتمع الميكروبي على مجموعة واسعة من التربة في الدراسات الزراعية والنظم الإيكولوجية واسعة النطاق 36 و 37 و 38 و 42 و 43 و 44 و 45 و 46 و 47 و 48 و 49 و 50 .
يتم الجمع بين الطبقات الدهنية مع هذا الأسلوب، وربما يكون هناك فقدان المعلومات الواردة في تلك الطبقات منفصلة 22 ، 39 ، ولكن الجمع بين الطبقات الدهون قد تعزز القدرة على الكشف عن أصل الفطريات الفطرية ميكروهيزال من ω5c 16: 1 من كل من الفوسفور – ومحايدة الدهون 40 . وبالإضافة إلى ذلك، في حين رقد يكون عدد الأحماض الدهنية غير المعروفة (التي يمكن أن تكون مشتقة من المواد العضوية غير الحية) أعلى مع هذا الأسلوب، فقد تبين أن أقل من ميدي-فا ويسمح للمقارنة العلاج من التشكيلات الدهنية من الدراسات مع العديد من العينات حيث عينة والقدرة الإنتاجية هي مصدر قلق 15 . ويعتقد عموما أن الجزء المحايد ينبع أساسا من دهون التخزين التي تنتجها الفطريات، على الرغم من أنه قد يكون هناك أيضا بعض المساهمة الأصغر من حيوانات التربة 41 . في ضوء هذا، فإن الطريقة الموصوفة هنا قد تسفر عن نتائج تظهر مساهمة أكبر من الدهون الفطرية 18: 2 ω 6،9c و 18: 1 ω 9C من بلفا. وتشمل الدهون الأخرى التي تميل إلى الظهور في جزء محايد بعض الأحماض الدهنية المشبعة، على سبيل المثال 16: 0، 18: 0، 20: 0.
هناك طرق مختلفة حيث يمكن التعبير عن البيانات الدهنية وتحليلها. التمثيل الأكثر شيوعا هي وفرة (نمول ز -1 التربة)، كسور الخلدن (نمول الدهون الفردية نمول -1 مجموع الدهون)، و الخلد في المئة (جزء الخلد * 100). تطبيع من قبل الدهون الكلية في العينة، وجزء الخلد والخلية في المئة هي قياسات للوفرة النسبية من الدهون معين. بعد التحول المناسب، على سبيل المثال ، أركسين الجذر التربيعي، جزء الخلد هو مناسب للاستخدام في التحليل من قبل المكونات الرئيسية أو التكرار تحليل التحليل. وفرة هو المبلغ المطلق للدهون المستخرجة المستخرجة لكل غرام من التربة. لأن كمية الدهون في الخلية ثابتة بشكل معقول، واستخراج الدهون عالية الكفاءة وشاملة، وفرة الكلي هو تقدير جيد من الدهون الإجمالية ووفرة من المؤشرات الرئيسية تعكس الكتلة الحيوية للمجموعة الإيكولوجية التي تمثل 17 . وأخيرا، طريقة جيدة للنظر في تكوين المجتمع الميكروبي هو استخدام طرق تحليل متعددة المتغيرات 16 ، على سبيل المثال ، أساليب التنسيق مثل التحجيم متعدد الأبعاد غير المتماثلة (نمدس -التي لا تحتاج إلى تحويل البيانات) أو تحليل المكونات الرئيسية (يكا)، يمكن أن تكون مفيدة لمقارنة الوفرة النسبية لجميع المؤشرات الحيوية للدهون.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مركز البحيرات العظمى لبحوث الطاقة الحيوية التابع لوزارة الطاقة (مكتب العلوم البيولوجية التابع لوزارة الطاقة دي-FC02-07ER64494) ومكتب كفاءة الطاقة والطاقة المتجددة التابع لوزارة الطاقة (دي-AC05-76RL01830). ويود المؤلفون أن يعترفوا بأندرس غوردا لصاحبه ومساهمته الماهرة في التصوير بالفيديو والتحرير.
RapidVap | Labconco | 7900000 | Evaporative system |
RapidVap | Labconco | 7491400 | Sample block |
Chem-resistant vacuum pump | Labconco | 7584000 | Vacuum pump |
Chemical trap cannister | Labconco | 7815300 | Trap cannister |
Solvent insert | Labconco | 7515200 | Solvent trap insert |
Diaphragm pump | Welch | 7398000 | DryFast vacuum pump |
Water bath | Fisher | 15-462-15Q | 2 well water bath |
Gas chromatograph | Various | N/A | For sample analysis |
Centrifuge | Various | N/A | For sample separation |
Freeze Dryer | Various | N/A | For sample lyophilization |
Repipet (6) | BrandTech | 4720440 | For dispensing reagents |
Vortex | Fisher | 02-215-365 | Analog vortex mixer |
Teflon centrifuge tubes | Thermo/Nalgene | 3114-0030 | Teflon sample tubes |
Caps | Thermo/Nalgene | DS3131-0020 | Caps for teflon tubes |
Test tube | Corning | 9825-16 | 16x100mm tubes |
Test tube | Corning | 9825-16xx | 16x150mm tubes |
Caps | Corning | 9998-15 | 15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner |
Pasteur pipets | Fisher | 13-678-20B | 14.6cm |
500 uL glass syringe | Fisher | 13684106LC | Hamilton 81217 |
Amber vials | Agilent | 5182-0716 | 4mL Amber vials |
Caps | Agilent | 5182-0717 | Blue screw caps |
Inserts | Agilent | 5181-3377 | 400uL flat bottom glass inserts |
Standards | |||
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate) | VWR | TCN0459-5G | Analytical standard |
Chemicals | |||
Dipotassium phosphate (K2HPO4 – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Phosphate-Buffer |
Methanol (CH3OH – HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 2 |
Sodium hydroxide (NaOH – ACS grade or better) | Various | N/A | For making Reagents 1 & 4 |
Hydrochloric acid (6N HCL) | Various | N/A | For making Reagent 2 |
Hexane (HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |
MTBE (Methyl tert-butyl ether – HPLC grade or better) | Various | N/A | For making Reagent 3 |