Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.
Microfluïdische modellen van hemostase beoordelen bloedplaatjes functie onder omstandigheden van hydrodynamische afschuifkrachten, maar in aanwezigheid van anticoagulantia, wordt deze analyse beperkt tot bloedplaatjes afzetting. De ingewikkelde relatie tussen Ca 2+ -afhankelijke stolling en bloedplaatjes functie vereist een zorgvuldige en gecontroleerde recalcificatietijd van het bloed voorafgaand aan analyse. Onze setup maakt gebruik van een Y-vormige mengen kanaal, dat geconcentreerde Ca 2+ / Mg 2+ buffer levert aan stromend bloed vlak voor perfusie, waardoor een snelle recalcificatietijd zonder monster stasis. Een tienvoudige verschil in stroomsnelheid tussen beide reservoirs minimaliseert verdunning. De recalcified bloed wordt vervolgens doorbloed in een met collageen beklede analyse kamer, en differentiële labeling maakt real-time beeldvorming van zowel het aantal bloedplaatjes en fibrine afzetting met behulp van fluorescentie microscopie video. Het systeem gebruikt handel verkrijgbare instrumenten, de kansen op normalisatie. Reconstructie van thrombocytopenic bloed met plaatjes van dwarshelling concentreert zich bovendien modellen bloedplaatjestransfusie, bewijst het gebruik ervan in dit onderzoeksdomein. Voorbeeldgegevens aangetoond dat coagulatie begin en fibrine depositie was lineair afhankelijk van de concentratie van bloedplaatjes, hetgeen de verhouding tussen de primaire en secundaire hemostase in ons model. In een tijdsbestek van 16 perfusie min, had contact activering niet plaats, ondanks recalcificatietijd normaal Ca 2+ en Mg 2+ niveaus. Wanneer coagulatie factor XIIa werd geremd door maïs trypsineremmer deze periode was zelfs langer, hetgeen een aanzienlijke dynamische bereik waarin de veranderingen in de procoagulant aard van de bloedplaatjes kan worden beoordeeld. Co-immobilisatie van tissue factor met collageen verminderde significant de tijd tot begin van bloedstolling, maar niet de snelheid. De mogelijkheid om de weefselfactor en / of de contact route bestuderen verhoogt de veelzijdigheid en het nut van de test.
Primaire en secundaire hemostase werden oorspronkelijk opgevat als twee relatief gescheiden biochemische processen. Primaire hemostase werd gezien als een belangrijke bijdrage van de arteriële stroomomstandigheden, die een sleutelrol vervullen voor bloedplaatjes, terwijl secundaire hemostase waargenomen coagulatie domineren onder veneuze bloedstroom, waardoor de protease cascade om onoplosbaar fibrine te vormen. De laatste decennia hebben deze traditionele opvatting aanzienlijk hervormd, erkennen dat bloedplaatjes activering en stolling van elkaar afhankelijk zijn en zijn even belangrijk processen tijdens fysiologische en pathologische hemostase in alle (niet-extreme) hydrodynamische milieus. Deze visie is vertaald naar de kliniek, waar de assays bedacht om volledig te meten hele bloedstolling worden steeds vaker gebruikt, zij het met veel resterende vragen over de relevantie, toepasbaarheid en het nut 1.
We hebben onlangs een functionele analyse van bloedplaatjesconcentraten gebruikt microfluïdische stroomkamers bekleed met fibrillair collageen in een in vitro model van transfusie 2, met monsters die normale hoeveelheid rode bloedcellen, plasma en bloedplaatjes. Deze werkwijze gebruikt heparine of hirudine anticoagulanteerd bloed, impliceert geen of beperkte betrokkenheid secundaire hemostase, die afhankelijk is van trombinevorming en geïoniseerd calcium (Ca2 +). Trombine vorming ondersteunen en aldus alle aspecten van hemostase onder microfluïdische stroom omvatten, ontwikkelden we een aanvullende methode hetzelfde technische platform, nu ook vrij Ca2 +. Zo kan afzetting van trombocyten en fibrinevorming bestudeerd, opnieuw in een model van trombocytentransfusie, bloedplaatjes concentraat kwaliteit te beoordelen.
In deze werkwijze worden de bloedplaatjes en fibrinogeen gelabeld met fluoroforen die volledig emissiespectra gescheiden. Tweekleurige, real-time video microscopie maakt dan is de analyse van deprimaire bloedplaatjesadhesie, alsmede coagulatie initiatie en fibrine depositie. Een belangrijke variabele in dit type test is recalcificatietijd, omdat de toevoeging van Ca2 + statische bloed vóór perfusie, zal onvermijdelijk contact geïnitieerde coagulatie in de houder veroorzaken. Deze initiatie zal vertekening van de uitlezing als gevolg van verstopping van de slang en biochip inhammen voorafgaand aan de perfusie. Dus in onze werkwijze, citraat geanticoaguleerd bloed en Ca2 + -bevattende buffer afzonderlijk gepompt door de bovenbenen van een Y-vormige inlaatkamer. De componenten worden gemengd tijdens perfusie alvorens een analysekamer bekleed met alleen of in combinatie met recombinant humaan weefselfactor (rhTF) collageen. Door het aanpassen van de stroomsnelheden van de afzonderlijke pompen en de concentratie van Ca2 + in de buffer, een 10% verdunning van het laatste bloedmonster plaatsvindt.
Gebruik van deze uitgebreide protocol tonen we de bijdrage van coagulatie factor XII (FXII) en bloedplaatjes concentratie contact route coagulatie initiatie onder stroom. Onze gegevens tonen ook aan dat door bekleding rhTF naast collageen, de tissue factor pathway kan gelijktijdig gemeten.
Transfusie van bloedplaatjes concentraten wordt voorgeschreven voor de trombocytopenische patiënt te voorkomen of te stoppen met bloeden. De klinische impact werd onlangs benadrukt in een historisch overzicht van acute leukemie 12, eraan herinnerend dat verhoogde overlevingskansen van pediatrische patiënten in de jaren zestig en zeventig waren grotendeels toe te schrijven aan de verbetering van (trombocyten) transfusiegeneeskunde. Bloedplaatjes concentraten worden ook gebruikt om stam bloeden in acuut trauma of tijdens de operatie. Onder deze omstandigheden worden plaatjes met uitstekende stollingsbevorderende eigenschappen die snel hemostase initiëren voorkeur, maar bloedplaatjes concentraten worden bereid uit donaties van vrijwillige donors en, in tegenstelling farmacologische medicatie, zijn gestandaardiseerd door voorbereidende, niet door (chemische) samenstelling. Daarom is een aantal vragen op het gebied van bloed bankieren zijn onbeantwoord, waaronder die op een optimale donatie modaliteiten, de bewaarcondities en de transfusie praktijken. Op het gebied van platelet (transfusie) biologie, veel vragen op mobiele klaring uit de circulatie, de bijdrage van transfusie bloedplaatjes aan hemostase, of hun immunologie ook blijven onbeantwoord.
Tal van laboratoriumtechnieken voor de bloedplaatjes functie analyse beschikbaar zijn, maar deze zijn vooral bestemd voor een bijzonder aspect van de functie van de bloedplaatjes, zoals aggregatie of degranulatie 13. In grote lijnen bloedplaatjes en bloedplaatjes concentraten te beoordelen, uitgebreide modellen van hemostase zijn onmisbaar, en deze moeten hydrodynamica bevatten. Bloedreologie cruciaal bloedplaatjes gedrag correct te interpreteren in hemostase 14, 15 of 16 trombose, zelfs als anticoagulatie verhindert Ca2 + en / of trombine te nemen in aanwezigheid van citraat of heparine respectievelijk 2. Om de wisselwerking tussen coagulatie en functie van de bloedplaatjes studeren onder stroom 17, 18, normale trombinevorming is vereist, en derhalve vrij Ca2 + ook. De experimentele opstelling voor het bestuderen hemostase onder deze omstandigheden is complex, omdat maatregelen "artefact" of ongecontroleerde activering van bloedstolling moet zoveel mogelijk worden voorkomen. Bovendien hebben veel gespecialiseerde onderzoeksgroepen gebruiken op maat gemaakte hardware 19, 20, die een aanzienlijke inter-laboratorium variabiliteit veroorzaakt 5. Typische beperkingen van deze benadering is het gebruik van rechthoekige vorm, niet-pulserende stromingsprofielen en niet-humane oppervlaktebekledingen 5. De test hier beschreven gebruikt handel verkrijgbare gereedschappen en derhalve geschikt zijn voor normalisatie.
Omdat de stollingscascade reactie gemakkelijk wordt geactiveerd zodra bloed niet is opgenomen in het menselijk lichaam, bestuurd recalcificatietijd is een cruciale stap. To dit te bereiken, de toevoeging van Ca 2+ moet worden uitgesteld tot vlak voor perfusie over de reactieve collageen oppervlak, want als de Ca 2+ buffer wordt geleverd in bulk aan statische bloed, stolling vindt onvermijdelijk plaats, uiteindelijk verstopping van de slang en vertekenende data interpretatie (gegevens niet getoond). De oplossing voor dit probleem is om de Ca2 + buffer en het bloed afzonderlijk te pompen, waardoor het mengen van convectie en diffuse krachten tijdens perfusie op weg naar de analysekamer. Volledige menging wordt bereikt in een 46-cm slangsegment tussen de meng- en analyse kamers. Deze lengte werd berekend voor de optimale verblijftijd van de reagentia te mengen op basis van fundamentele wetten van massa- en convectief transport 21 tijdens perfusie met een debiet gebruikt (1000 s-1). Deze aanpak bleek controleerbaar en reproduceerbaar.
Contactactivering van coagulatie wordt soms gezien als een artefact van eenvoudigebemonstering en bloed te vermijden bij de interpretatie van stollingstijden. Daarom hebben we aangetoond dat, in afwezigheid van remmers, contact-geïnduceerde coagulatie begint bij 16,7 min (± 3,7 min) van perfusie. In aanwezigheid van CTI tot FXIIa gemedieerde contact activatie remt, wordt in de coagulatie niet willekeurig gedefinieerd verloop van het experiment (30 min) ingeleid. Dit venster van experimenteren is voldoende lang om monsters die pro- of anti-trombose zijn te onderscheiden. Hoewel coagulatie bij contact met de activering van een ongewenst gevolg van het bloed in contact brengen kunstgras kan zijn, onze gegevens tonen een duidelijke biologische dosis effect van bloedplaatjes. Dit kan van belang zijn voor transfusie geneeskunde, omdat recente bevindingen op FXII, bloedplaatjes polyfosfaten 10, fosfatidylserine distributie 22 en bloedplaatjes micropartikels 23 daadwerkelijk geherwaardeerd contact route coagulatie als een belangrijke bijdrage aan de hemostase, evooral in de context van trombose 24. Bijvoorbeeld kan de variabele opbrengst aan bloedplaatjes bij patienten of variabele phosphatidylserine expressie van opgeslagen bloedplaatjes aldus variabiliteit induceren therapeutische werking indien succesvol coagulatie wordt getoond afhankelijk van deze factoren.
Door co-immobilisatie gelipideerde rhTF met collageen, de extrinsieke coagulatie route of TF route wordt geactiveerd tijdens afzetting van bloedplaatjes op collageen. Hierdoor wordt de bepaling om de meest uitgebreide modus als voorbeeld voor verwondingen die bloed in contact brengen met TF-dragende cellen en weefsels. Onze gegevens tonen aan dat co-immobilisatie van collageen en TF vermindert het moment van coagulatie optreden, maar niet de snelheid van de bloedstolling niet. Van belang is de hoeveelheid rhTF geïmmobiliseerd aan het oppervlak is een belangrijke variabele in het model 25, 26 en gelijk te trekken binnen een gegeven onderzoek. In de presence CTI, kan het TF pathway uitsluitend bestudeerd (niet getoond) omdat contactactivering voorkomen.
Concluderend onze experimentele opstelling combineert een model van transfusie door reconstitutie van trombocytopenische bloed met dwarshelling bloedplaatjes en een model van hemostase door calcium-afhankelijke afzetting van trombocyten en fibrinevorming onder hydrodynamische stroming. Deze test wordt gebruikt om vragen over de procoagulant aard van opgeslagen bloedplaatjes beantwoorden en de effecten bloedplaatjesconcentraat bereidingstechnieken hebben op deze.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door de Stichting voor Onderzoek en Ontwikkeling van het Belgische Rode Kruis-Vlaanderen Dienst voor het Bloed. Wij erkennen financiële steun van "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF – BOF) aan de Universiteit Gent voor het project met een contract nummer BOF30290744.
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |