La maduración de madre humanas cardiomiocitos derivado de células en Biowires uso de la estimulación eléctrica

Resumen

La plataforma biowire cardiaca es un método in vitro utilizado para madurar embrionario humano y los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (HPSC-CM) combinando el cultivo de células en tres dimensiones con la estimulación eléctrica. Este manuscrito presenta la configuración detallada de la plataforma biowire cardíaco.

Resumen

Los cardiomocitos derivados de células madre pluripotenciales humanas (hPSC-CMs) han sido una fuente prometedora de células y por lo tanto han fomentado la investigación de sus aplicaciones potenciales en la investigación cardíaca, incluyendo el descubrimiento de fármacos, modelación de enfermedades, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Sin embargo, las células producidas por los protocolos existentes muestran un rango de inmadurez en comparación con los cardiomiocitos ventriculares adultos nativos. Se han hecho muchos esfuerzos para madurar hPSC-CMs, con sólo maduración moderada alcanzada hasta el momento. Por lo tanto, se ha ideado un sistema de ingeniería, llamado biowire, proporcionando señales tanto físicas como eléctricas para conducir los hPSC-CM a un estado más maduro in vitro . El sistema utiliza una plataforma microfabricada para sembrar hPSC-CMs en gel de colágeno tipo I a lo largo de una sutura moldeada rígida para ensamblar en tejido cardiaco alineado (biowire), que es sometido a estimulación de campo eléctrico con una frecuencia progresivamente creciente. En comparación con los controles no estimulados,estimularon biowired cardiomiocitos exhiben un grado mejorado de maduración estructural y electrofisiológico. Tales cambios son dependientes de la velocidad de estimulación. Este manuscrito describe en detalle el diseño y creación de biowires.

Introducción

terapia basada en células es una de las estrategias más prometedoras e investigados para lograr la reparación cardíaca / regeneración. Se ha ayudado por la ingeniería de tejidos cardíaco y el co-suministro de biomateriales ^{1, 2.} La mayoría de las fuentes de células disponibles se han estudiado en modelos animales por sus efectos potencialmente beneficiosos sobre dañadas o envejecidas corazones enfermos ^3. En particular, se han hecho esfuerzos significativos para utilizar células madre pluripotentes humana (HPSC) derivada de los cardiomiocitos (HPSC-CM), una fuente de células autólogas ....

Protocolo

1. Diseño principal y Fabricación

NOTA: El uso de litografía blanda para la fabricación del dispositivo. Hacer una de dos capas SU-8 maestro para polidimetilsiloxano de moldeo (PDMS).

1. Diseñar el dispositivo mediante un diseño y elaboración de software (Figura 1A, izquierda). Dibuje cada capa del maestro por separado. Imprimir el diseño del dispositivo en dos fotomáscaras en 20.000 dpi, correspondiente a las dos capas del maestro ^15. Ajuste el modelo dispositivo como transparente y sus alrededores como oscuro; las máscaras servirán como plantilla para transferir ópticamente el patrón disp....

Resultados

El racional para el uso de una sutura en las biowires es servir como una plantilla para la formación de constructos 3D que se alinean en un eje y imitan la forma de fibras cardíacas. Se demuestra que después de siete días de cultivo en el biowire, las células remodelado el gel alrededor de la sutura (Figura 3A). Las células montadas a lo largo del eje de la sutura para formar alineados tejido cardíaco (Figura 3). Después de 7 días de precultivo, las biow.......

Discusión

Este manuscrito describe la configuración e implementación de la plataforma de ingeniería, biowire, para mejorar la maduración de HPSC-CM. El dispositivo se puede realizar en instalaciones de microfabricación estándar, y biowires puede ser producido con técnicas de cultivo celular comunes y un estimulador eléctrico.

Hasta donde sabemos, no existe un método similar al reportado biowires. Esta estrategia revela que la mejora de las propiedades de maduración eran dependientes de la pauta de est.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido L-ascórbico	Sigma	A-4544	hPSC-CM compuesto de medios de cultivo
AutoCAD	Autodesk, Inc		Software para diseñar
dispositivo Varillas de carbono, Ø 3 mm			Componente de la cámara del estimulador eléctrico
Colágeno, tipo 1, cola de rata	BD Biosciences	354249	Gel de colágeno: 2,1 mg/mL de colágeno de cola de rata tipo I en 24,9 mM de glucosa, 23,8 mM de NaHCO3, 14,3 mM de NaOH, 10 mM de HEPES, en 1x M199 con 10 % de Matrigel reducido en factor de crecimiento.
Colagenasa tipo I	Sigma	C0130	0,2% colagenasa tipo I (p/v) y 20% FBS (v/v) en PBS con Ca2+ y Mg2+. Esterilizar con 0.22 μ m filtrar y hacer alícuotas de 12 mL. Almacenar a -20 °C.
Desoxirribonucleasa I (DNasa I)	EMD Millipore	260913-25MU	Prepare una solución madre de DNasa I de 1 mg/mL en agua. Filtre el estéril y almacene alícuotas de 0,5 mL a &menos; 20 ° C
Taladro y brocas (Ø 1 mm y 2 mm)	Dremel		Taladro agujeros en marcos de policarbonato
Estimulador eléctrico	Grass	s88x
Suero fetal bovino (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D-(+)-Glucosa	Sigma	G5767	Componente de gel
de colágeno L-Glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ &punto medio; cm a 25 ° C, ultrapuro, para hacer todas las soluciones
HEPES	Sigma	H4034	Componente de gel de colágeno
Placa caliente	Torrey Pines	HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053
alineador de mascarillas	EVG	EVG 620
Matrigel, factor de crecimiento reducido	Corning	354230	Componente de gel de colágeno
Medio 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11825015	Componente de gel de colágeno
Monotioglicerol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM compuesto de medios de cultivo
Agitador orbital	VWR	89032-088
Penicilina/estreptomicina (P/S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Ca2+ y Mg2+	14040133		Thermo Fisher Scientific
(6 pocillos)	353046		Corning
(6 pocillos), fijación baja	Alambres de platino Corning	3471
0,2 mm			Componente de la cámara del estimulador eléctrico
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Éter monometílico de propilenglicol acetato (PGMEA)	Doe & Ingalls Inc.		Para desarrollar la bolsa de oblea
, Convertidores de apertura despegable		92308	Para esterilización por vapor
Oblea de silicona, 4 pulgadas	UniversityWafer Inc.
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma	S5761	Componente de gel
de colágeno Hidróxido de sodio	Sigma	S8045	Componente de gel de colágeno
Recubridor Sprin	Sistemas de recubrimiento especiales	G3P-8
Medio de cultivo StemPro-34	Thermo Fisher Scientific	10639011	Medio de cultivo hPSC-CM. Para hacer 50 mL, agregue 1.3 mL de suplemento, 500 μ L de 100 veces; L-Glutamina, 250 μ L de 30 mg/mL de transferrina, 500 μ l de 5 mg/mL de ácido ascórbico, 150 μ L de 26 μ l /2 mL de monotioglicerol (MTG) y 500 μ L (1 %) penicilina/estreptomicina.
Medios			de parada Medio de lavado: FBS (1:1)
SU-8 50	MicroChem Corp.		fotorresistente, componente maestro
SU-8 2050	MicroChem Corp.		fotorresistente, componente maestro
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM compuesto de medios de cultivo
Tripsina/EDTA, 0,25%	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM compuesto de medios de cultivo
Medio de lavado			IMDM que contiene 1% de penicilina/estreptomicina

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