Describimos un método para el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación de gránulos de estrés en células de mamíferos después de que las células son desafiadas con bacterias y una serie de diferentes tensiones. Este protocolo puede aplicarse para investigar la respuesta de los gránulos de estrés celular en una amplia gama de interacciones huésped-bacteriana.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos
En este artículo
Resumen
Resumen
La imagen fluorescente de los componentes celulares es una herramienta eficaz para investigar las interacciones huésped-patógeno. Los patógenos pueden afectar muchas características diferentes de las células infectadas, incluyendo ultraestructura de organelos, organización de la red del citoesqueleto, así como procesos celulares como la formación de gránulos de estrés (SG). La caracterización de cómo los patógenos subvertir procesos de acogida es una parte importante e integral del campo de la patogénesis. Mientras que los fenotipos variables pueden ser fácilmente visibles, el análisis preciso de las diferencias cualitativas y cuantitativas en las estructuras celulares inducidas por el desafío del patógeno es esencial para definir diferencias estadísticamente significativas entre muestras experimentales y de control. La formación de SG es una respuesta de estrés evolutivamente conservada que conduce a respuestas antivirales y se ha investigado durante mucho tiempo utilizando infecciones virales 1 . La formación de SG también afecta a las cascadas de señalización y puede tener otras consecuencias aún desconocidas2 . La caracterización de esta respuesta de estrés a patógenos distintos de los virus, como los patógenos bacterianos, es actualmente un área de investigación emergente 3 . Por ahora, el análisis cuantitativo y cualitativo de la formación de SG aún no se utiliza rutinariamente, incluso en los sistemas virales. Aquí describimos un método sencillo para inducir y caracterizar la formación de SG en células no infectadas y en células infectadas con un patógeno bacteriano citosólico, lo que afecta a la formación de SGs en respuesta a diversas tensiones exógenas. El análisis de la formación y composición de SG se logra utilizando un número de diferentes marcadores SG y el detector de puntos del plug-in ICY, una herramienta de análisis de imágenes de código abierto.
Introducción
La visualización de las interacciones huésped-patógeno a nivel celular es un método poderoso para obtener información sobre las estrategias patógenas y para identificar las vías celulares clave. De hecho, los patógenos pueden utilizarse como herramientas para identificar objetivos o estructuras celulares importantes, ya que los patógenos han evolucionado para subvertir los procesos celulares centrales como una estrategia para su propia supervivencia o propagación. La visualización de componentes celulares puede conseguirse mediante la expresión recombinante de proteínas huésped marcadas fluorescentemente. Aunque esto permite el análisis en tiempo real, la generación ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de bacterias y células huésped
- Transferir las tapas de cristal de 12 ó 14 mm en placas de 24 ó 12 pocillos, respectivamente, con pinzas estériles, contando un pocillo por condición experimental. Esterilizar estos por tratamiento UV en una campana de cultivo de tejidos durante 15 min.
NOTA: Incluya pocillos de control para la estimulación bacteriana y para la inducción de SG por estrés exógeno. - Para una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de 12 mm, sembrar 1 x 105 células de mamífero ( por ejemplo, células HeLa) sobre cubreobjetos; Presione los cubreobjetos hacia abajo con una punta de pipeta estéril. Dejar que las....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para explicar y demostrar el protocolo descrito en este manuscrito, se caracterizó la imagen de clotrimazole inducida SGs en células HeLa infectadas o no con el patógeno citosólico S. flexneri . Un esquema del procedimiento se presenta en la Figura 1 , e incluye virulenta y avirulenta S. flexneri rayado en placas de Congo Rojo, preparación de bacterias, infección, adición de estrés ambiental, fijación de muestras y tinción, imagen de muestr.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El protocolo descrito aquí describe la inducción, localización y análisis de SGs en células no infectadas y células infectadas con el patógeno citosólico S. flexneri en presencia o ausencia de estrés exógeno. Usando software de imagen libre, los protocolos permiten el análisis cualitativo y cuantitativo preciso de la formación de SG para identificar y tratar estadísticamente las diferencias en fenotipos dados.
Hay varios pasos críticos dentro del protocolo para la infección, SG-indu.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
PS es un ganador de la Bill y Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV recibió el apoyo de una beca de Postdoc Mobility de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y una beca postdoctoral Roux-Cantarini. PJS es compatible con una subvención HHMI y ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| eIF3b fuerte (N20), origen cabra | Santa Cruz | sc-16377 | Marcador SG robusto y ampliamente utilizado. La tinción citosólica permite la delineación celular. Dilución 1:300 |
| eIF3b (A20), origen cabra | Santa Cruz | sc-16378 | Mismo objetivo que eIF3b (N20) y en nuestras manos era idéntico al eIF3b (N20). Dilución 1:300 |
| eIF3A (D51F4), origen conejo (MC: monoclonal) | Señalización Celular | 3411 | Parte del complejo multiproteico eIF3 con eIF3b. Dilución 1:800 |
| eIF4AI, origen cabra | Santa Cruz | sc-14211 | Recomendado por (Ref # 13). Dilución 1:200 |
| eIF4B, origen conejo | Abcam | ab186856 | Buen marcador de gránulos de estrés en nuestras manos. Dilución 1:300 |
| eIF4B, origen conejo | Cell Signaling | 3592 | Recomendado por Ref # 13. Dilución 1:100 |
| eIF4G, origen | conejo Santa Cruz | sc-11373 | Marcador SG ampliamente utilizado. (Ref # 13): puede que no funcione bien en líneas celulares de ratón. Dilución 1:300 |
| G3BP1, origen conejo (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Marcador de SG ampliamente utilizado. Dilución 1:300 |
| Tia-1, origen cabra | Santa Cruz | sc-1751 | Marcador SG ampliamente utilizado. También se puede encontrar en cuerpos P cuando SG están presentes (Ref # 13). Dilución 1:300 |
| Anticuerpos secundarios conjugados con Alexa | |||
| A488 anti-cabra, origen burro | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilución 1:500 |
| A568 anti-cabra, origen burro | Thermo Fisher | A-11057 | De absorción cruzada. Dilución 1:500 |
| A488 anti-ratón, origen burro | Thermo Fisher | A-21202 | Dilución 1:500 |
| A568 anti-ratón, origen burro | Thermo Fisher | A10037 | Dilución 1:500 |
| A647 anti-ratón, origen burro | Thermo Fisher | A31571 | Dilución 1:500 |
| A488 anti-conejo, origen burro | Thermo Fisher | A-21206 | Dilución 1:500 |
| A568 anti-conejo, origen burro | Thermo Fisher | A10042 | Dilución 1:500 |
| Otros reactivos | |||
| Shigella flexneri | Disponible en varios laboratorios bajo pedido | ||
| Caldo de triptona caseína de soja (TCS) | BD Biosciences | 211825 | Medio de crecimiento estándar para Shigella, aplicación - crecimiento bacteriano |
| Agar TCS | BD Biosciences | 236950 | Agar de crecimiento estándar para Shigella, aplicación - crecimiento bacteriano |
| Congo rojo SERVA | Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Herramienta de descortezación para Shigell que han perdido el plásmido de virulencia, aplicación - crecimiento bacteriano |
| Poly-L-Lisina (PLL) | Sigma-Aldrich | P1274 | Útil para recubrir bacterias para aumentar la infección, aplicación - infección |
| Gentamicina | Sigma-Aldrich | G1397 | Muerte selectiva de bacterias extracelulares pero no citosólicas, aplicación - infección |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | Tampón de PH útil cuando las células se incuban en RT, aplicación - cultivo celular |
| Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) | Life Technologies | 31885 | Medio de cultivo estándar para células HeLa, aplicación - cultivo celular |
| Suero fetal de ternero (FCS) | Biowest | S1810-100 | Suplementación al 5% utilizada para el medio de cultivo celular HeLa, aplicación - cultivo celular |
| Aminoácidos no esenciales (NEAA) | Life Technologies | 11140 | dilución 1:100 utilizada para el medio de cultivo celular HeLa, aplicación - cultivo celular |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Diluyente de reactivo, aplicación - cultivo celular |
| Arsenito | de sodioSigma-Aldrich | S7400 | Potente inductor de gránulos de estrés (Nota: altamente tóxico, se requiere un manejo y eliminación especiales), aplicación - inductor de estrés |
| Clotrimazol | Sigma-Aldrich | C6019 | Potente inductor de gránulos de estrés (Nota: peligro para la salud, se requiere manejo y eliminación especiales), aplicación - inductor |
| de estrés Paraformaldehído (PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | El PFA al 4% se utiliza para la fijación estándar de células, aplicación - fijación |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Se utiliza al 0,03% para la permeabilización de las células huésped antes de la tinción inmunofluorescente, aplicación - permeabilización |
| A647-faloidina | Thermo Fisher | A22287 | La dilución es a 1:40, se añade mejor durante la tinción secundaria de anticuerpos, aplicación - tinción |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Tinción de ácido nucleido utilizada para visualizar tanto el núcleo del huésped como las bacterias, aplicación - tinción |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Película de parafina útil para la tinción inmunofluorescente de cubreobjetos, aplicación - tinción |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Medio de montaje robusto que funciona bien para la mayoría de los fluoróforos, aplicación - montaje |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Medio de montaje barato y robusto que funciona bien para la mayoría de los fluoróforos, aplicación - montaje |
| placa de cultivo celular de 24 pocillos | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Placas de cultivo de tejidos estándar, aplicación - cultivo celular |
| 12 mm cubreobjetos de vidrio | NeuVitro | 1001/12 | Soporte de cultivo celular para aplicaciones de inmunofluorescencia, aplicación - |
| pinza | Sigma-Aldrich | 81381 | Medio de montaje barato y robusto que funciona bien para la mayoría de los fluoróforos, aplicación - montaje |
| /fuerte> | |||
| pruebas estadísticas, aplicación - análisis de datos | |||
| adquisición | |||
| Imaris | Bitplane | Professional programa de análisis de imágenes, aplicación - análisis de datos | |
| Excel | Microsoft | Programa de análisis y gráficos de datos, aplicación - análisis de datos |
Referencias
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
