Preparación y caracterización de nuevas nanopartículas que imitan las HDL para la encapsulación del factor de crecimiento nervioso

Summary

Se utilizó una homogeneización simple para preparar nanopartículas nuevas, de alta densidad, que imitan las lipoproteínas para encapsular el factor de crecimiento nervioso. En este artículo se describen los desafíos, los protocolos detallados para la preparación de nanopartículas, la caracterización in vitro y los estudios in vivo .

Abstract

El objetivo de este artículo es introducir métodos de preparación y caracterización de nanopartículas (NPs) de alta densidad, lipoproteína (HDL) cargadas con factor de crecimiento nervioso (NGF). Los HDLs son NPs endógenos y han sido explorados como vehículos para el suministro de agentes terapéuticos. Se han desarrollado varios métodos para preparar NPs que imitan a HDL. Sin embargo, generalmente son complicados, requieren mucho tiempo y son difíciles para la ampliación industrial. En este estudio, se utilizó una homogeneización en un solo paso para mezclar los excipientes y formar el prototipo de NP. El NGF es una proteína soluble en agua de 26 kDa. Para facilitar la encapsulación de NGF en el medio lipídico de NPs que imitan a HDL, se usó protamina USP para formar un complejo de pares de iones con NGF para neutralizar las cargas sobre la superficie de NGF. El complejo NGF / protamina se introdujo entonces en el prototipo de NP. La apolipoproteína AI fue finalmente recubierta sobre la superficie de los NPs. NGF HDL imitación NPs mostraron propiedades preferibles en términosS de tamaño de partícula, distribución de tamaño, eficacia de atrapamiento, liberación in vitro , bioactividad y biodistribución. Con el cuidadoso diseño y exploración de la homogeneización en las NPs que imitan a HDL, el procedimiento se simplificó en gran medida y los NP se hicieron escalables. Además, se superaron varios desafíos, como la separación del NGF sin carga de los NPs, la realización de estudios fiables de liberación in vitro y la medición de la bioactividad de los NPs.

Introduction

Las macromoléculas, como las proteínas, los péptidos y los ácidos nucleicos, han aparecido como medicamentos prometedores y han adquirido considerable atención en las últimas décadas ^{1 , 2} . Debido a su alta eficacia y los modos de acción específicos, que muestran un gran potencial terapéutico para los tratamientos de cáncer, la enfermedad inmune, el VIH, y las condiciones relacionadas [ ^{3 , 4]} . Sin embargo, las propiedades fisicoquímicas, tales como su gran tamaño molecular, estructura tridimensional, cargas superficiales y naturaleza hidrófila, hac....

Protocol

NOTA: Los estudios en animales incluidos en todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad del Norte de Texas.

1. Preparación de nanopartículas NGF HDL-imitando

1. Disolver los excipientes, fosfatidilcolina (PC), esfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), oleato de colesterilo (CO) y succinato de D-α-tocoferil polietilenglicol (TPGS), en etanol para preparar soluciones madre a 1 mg / ml.
   NOTA: Las soluciones madre se alicuotaron y se almacenaron a -20ºC. El oleato de colesterilo se almacenó en botellas oscuras. Las soluciones madre de P....

Results

El esquema de ingeniería de NGF NPs recubierto con alpha - tocoferol imitando el HDL preparado por una estrategia de pares de iones se muestra en la Figura 1 . Para neutralizar las cargas superficiales de NGF, se usó protamina USP como un agente de pares de iones para formar un complejo con NGF. Para proteger la bioactividad, se diseñaron prototipos NPs que simulaban HDL, primero usando homogeneización; Entonces, el complejo NGF / protamina se encapsuló en el prototipo .......

Discussion

En este estudio, se demuestra un método simple para preparar HDL-imitación NPs para NGF encapsulación. Se han estudiado varios sistemas de liberación de NP para suministrar proteínas. Actualmente, muchas preparaciones NP incluyen diálisis, precipitación con disolventes e hidratación de películas. Estos procesos son generalmente complicados y desafiantes a escala. Durante este desarrollo de NP, se determinó que los lıpidos tenıan fuerte adhesión a la pared de vidrio del recipiente, lo que condujo a las dificultades para .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beta-NGF Humano Recombinante	Creative Biomart	NGF-05H
L-&alfa;-Fosfatidilcolina (PC)	Avanti	131601P	95%, Huevo, Pollo
Esfingomielina (SM)	Avanti	860062P	Cerebro, Porcino
Fosfatidilserina (PS)	Avanti	840032P	Cerebro, Porcino
Oleato de colesterilo (CO)	Sigma	C9253
D-α-Succinato de polietilenglicol de tocoferilo (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamina E Succinato de polietilenglicol Sulfato
protamina	Sigma	P3369	cumple con las especificaciones de prueba de la USP
Apolipoproteína A1, plasma humano	Athens Research & Tecnología	16-16-120101	1 mg en 671 y micro; L 10 mM NH4HCO3, pH 7,4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Agarosa reticulada,  filtración en gel Material de relleno de la columna de cromatografía
Kit ELISA sándwich para NGF	R& Sistema D	DY008
Albúmina sérica bovina	Sigma	A2153
RPMI-1640 medio	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Suero de caballo	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Suero fetal bovino	Gibco	10082147
PC12 células	ATCC	CRL-1721
Cola de rata colágeno tipo I	Sigma	C3867
Acetato de sodio	Sigma	S2889
Cloruro de sodio	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)	Sigma	P7626
Cloruro de bencetonio	Sigma	B8879
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipo
Homogeneizador	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC Analizador de partículas	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dispositivo de diálisis	Spectrum Laboratories	G235036	Corte de molécula 300 kDa
Centrífuga	Eppendoff	5424R
Polytron homogeneizador	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200