Het doel van dit protocol is om de voorbereiding, de cultuur, de behandeling en het immunostaining van neonatale muizencochleaire explantanten aan te tonen. De techniek kan gebruikt worden als een in vitro screening tool bij het horen onderzoek.
Hoewel er in de afgelopen decennia merkwaardige vooruitgang is geweest bij het horen van onderzoek, is er nog steeds geen remedie voor Sensorineural Hearing Loss (SNHL), een aandoening die typisch schade aan of verlies van de delicate mechanosensorische structuren van het binnenoor meebrengt. Geavanceerde in vitro es ex vivo assays zijn in de afgelopen jaren opgetreden, waardoor het mogelijk is om een steeds groter aantal potentiële therapeutische verbindingen te screenen, terwijl de middelen minder worden en de inspanningen om SNHL te ontwikkelen, worden versneld. Hoewel homogene culturen van bepaalde celtypes een belangrijke rol spelen in het huidige onderzoek, zijn veel wetenschappers nu gebaseerd op complexere organotypische culturen van muizen innerlijke oren, ook wel cochleaire explanteren genoemd. Het behoud van georganiseerde cellulaire structuren in het binnenoor vergemakkelijkt de in-situ evaluatie van verschillende componenten van de cochleaire infrastructuur, met inbegrip van binnen- en buitenhaarcellen, spirale ganglionneuronen, neurItes en ondersteunende cellen. Hier presenteren wij de voorbereiding, de cultuur, de behandeling en het immunostaining van neonatale muizencochleaire explantanten. De zorgvuldige voorbereiding van deze explanteren vergemakkelijkt de identificatie van mechanismen die bijdragen aan SNHL en vormen een waardevol hulpmiddel voor de gehooronderzoeksgemeenschap.
Sensorineurale gehoorverlies (SNHL) weerspiegelt schade aan het binnenoor of oplopende auditieve weg. Terwijl gehoorverlies het meest voorkomende sensorische tekort bij mensen 1 is , zijn er nog geen genezende therapieën 2 . Hoewel cochleaire of auditieve hersenstamimplantaten een zekere mate van gehoor kunnen herstellen voor patiënten met ernstige tot diepgaande SNHL, is de gehoor die door deze apparaten wordt geleverd nog steeds heel anders dan 'natuurlijk' gehoor, vooral tijdens pogingen om spraak in geluid te begrijpen of muziek te luisteren.
Hoewel de degeneratie van de haarcellen al lang is beschouwd als het belangrijkste gevolg van traumatische auditieve gebeurtenissen ( bijv. Blootstelling aan luid geluid), is er steeds meer bewijs dat de synaptes die informatie overdragen van haarcellen naar de auditieve zenuw ten minste zo kwetsbaar zijn voor akoestisch trauma 3 , 4 , 5 </sup > , 6 . Aangezien menselijke audiometrische drempels, de huidige gouden standaard voor de evaluatie van de gehoorfunctie, geen specifieke cellulaire schade in het binnenoor voorspellen, zijn er meer verfijnde gereedschappen nodig om de degeneratie van de cel zo snel mogelijk te detecteren en adequate behandeling te starten 7 .
Veelbelovende farmaceutische behandelingen voor gehoorverlies worden vaak getest op homogene celculturen in vitro , maar dergelijke systemen passen de cochleaire micro-omgeving niet nauwkeurig aan. Cochleaire cellen zijn bekend om trofische factoren te scheiden die andere celtypen binnen de cochlea 8 , 9 beïnvloeden, een cruciaal in vivo proces dat verloren gaat wanneer het orgaan van Corti 10 , 11 of Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 afzonderlijk wordt gekweekt of wanneer Moleculaire markers worden geanalyseerdEf "> 13. In vivo studies die nodig zijn voor de validatie van in vitro data om nieuwe, gepersonaliseerde behandelingen voor gehoorverlies in het nastreven van" precisie geneeskunde "te ontwikkelen, vereisen echter aanzienlijke middelen en tijd. Dit is vooral relevant bij het overwegen van Hoeveel inspanning nodig is om de middenoor- of ronde-venstermembraaninjecties te perfectioneren en uit te voeren met gehoorproeven en de daaropvolgende dissectie van cochleaire full-mounts. De efficiënte screening van veelbelovende verbindingen in organotypische ex vivo culturen, bekend als cochleaire explantanten, biedt een economisch en betrouwbaar alternatief 14 , 15 , 16 , 17 .
In dit artikel wordt een protocol beschreven waarmee u behandelde cochleairexplants kan genereren, onderhouden en evalueren. Specifieke toepassingen voor dit model worden benadrukt, inclusief het gebruik ervan bij het screenenVan potentieel therapeutische verbindingen en de vergelijkende evaluatie van virale vectoren voor gentherapie. Een ex vivo explantieve benadering laat onderzoekers toe om de effecten van een gegeven behandeling op verschillende celpopulaties in situ te visualiseren, waardoor de identificatie van celltypespecifieke mechanismen en de daaropvolgende verfijning van gerichte therapeutica wordt vergemakkelijkt.
Over het geheel genomen biedt deze techniek een model om de cochlea ex vivo te bestuderen, terwijl vitale kruisbesprekingen tussen de veel verschillende celsoorten die in de cochlea bestaan, behouden blijven.
Onderzoekers moeten de dissectietechniek perfect maken voordat ze experimenten uitvoeren met cochleaire explanteren. Haarcellen worden doorgaans beschadigd tijdens dissecties die vroeger in de leercurve worden uitgevoerd. Een bijzonder problematisch moment voor hun integriteit is het verwijderen van het tectoriale membraan, dat vaste handen, juiste gereedschappen en ervaring vereist. Om tijd en middelen te besparen, dient een visuele controle onder de dissectiemicroscoop te worden uitgevoerd en moet eventueel beschadigd…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Nationale Instituut voor Doofheid en Andere Communicatie Stoornissen, subsidies R01DC015824 (KMS) en T32DC00038 (SD ondersteunend), het ministerie van Defensie-subsidie W81XWH-15-1-0472 (KMS), de Bertarelli Foundation (KMS) Nancy Sayles Day Foundation (KMS) en het Lauder Tinnitus Research Center (KMS). Wij danken Jessica E. Sagers, BA voor inzichtige opmerkingen over het manuscript.
Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Distilled water, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml | EMD Millipore | TMS-006-B | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
N-2 Supplement (100X), 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick | Zipline | 0609132541599 |