Aquí, describimos un protocolo para el genoma de la cartografía de los sitios de integración Moloney murino leucemia virus basados en retrovirus vectores en células humanas.
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Artículo de método
Escaneo Retroviral: Mapeo de sitios de integración MLV para definir regiones reguladoras específicas de células
En este artículo
Resumen
Resumen
Los vectores retrovirales basados en virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) se integran predominantemente en potenciadores y promotores acetilados. Por esta razón, los sitios de integración mLV pueden usarse como marcadores funcionales de elementos reguladores activos. Aquí, presentamos una herramienta de exploración retroviral, que permite la identificación a nivel genoma de potenciadores y promotores específicos de células. En resumen, la población de células diana se transduce con un vector derivado de mLV y el ADN genómico se digiere con una enzima de restricción de corte frecuente. Después de la ligación de fragmentos genómicos con un enlazador de ADN compatible, la reacción en cadena de polimerasa mediada por enlazador (LM-PCR) permite la amplificación de las uniones genómicas virus-huésped. La secuenciación masiva de los amplicones se utiliza para definir el perfil de integración de mLV en todo el genoma. Finalmente, se definen grupos de integraciones recurrentes para identificar regiones reguladoras específicas de células, responsables de la activación de programas transcripcionales específicos de tipo celular.
por ejemplo, células madre somáticas) que carecen de marcadores robustos para el aislamiento prospectivo.
Introducción
La identidad celular se determina mediante la expresión de conjuntos específicos de genes. El papel de los elementos reguladores cis, tales como promotores y potenciadores, es crucial para la activación de programas de transcripción específicos de tipo celular. Estas regiones reguladoras se caracterizan por características específicas de la cromatina, tales como modificaciones peculiares de las histonas, factores de transcripción y unión de co-factores, y accesibilidad a la cromatina, que han sido ampliamente utilizados para su identificación genómica en varios tipos de células 1 , 2 ,
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Protocolo
1. Transducción MLV de células humanas
- Aislar las células diana y transducirlos con un vector retroviral derivado de mlV que alberga el gen reportero eGFP y pseudotipado con el virus de la estomatitis vesicular G (VSV-G) o la glicoproteína de la envoltura anfotrópica 16 .
- Mantenga las células simuladas transducidas como un control negativo para los siguientes análisis. Dado que los vectores retrovirales basados en mLV pueden transducir células que se dividen eficazmente, cultivan la población de células diana en condiciones que estimulan la división celular. Las condiciones de transducción necesitan ser o....
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Resultados
Flujo de trabajo del procedimiento de exploración retroviral
El flujo de trabajo del procedimiento de exploración retroviral se esquematiza en la Figura 1 . La población de células diana se purifica y transduce con un vector retroviral derivado de mlV que expresa un gen informador eGFP. El transgén está flanqueado por las dos repeticiones terminales largas idénticas (5 'y 3' LTR), asegurando .......
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Discusión
Aquí, hemos descrito un protocolo para el genoma de la cartografía de los sitios de integración de mLV, un retrovirus que las regiones de la cromatina objetivo, epigenéticamente marcado como promotores activos y potenciadores. Los pasos críticos y / o limitaciones del protocolo incluyen: (i) transducción mLV de la población de células diana; (Ii) amplificación de las uniones huésped-virus por LM-PCR; (Iii) recuperación de una alta fracción de sitios de integración. Los vectores retrovirales basados en mLV transfieren .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), el Ministerio Italiano de Educación, Universidades e Investigación (FIRB-Futuro en Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro en Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), el Ministerio Italiano de Salud (Jóvenes Investigadores llaman 2011 GR-2011-02352026) y la Imagine Institute Foundation (París, Francia).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PBS, pH 7,4 | ThermoScientific | 10010031 | o equivalente |
| Suero fetal bovino | ThermoScientific 16000044 | o equivalente | |
| Tubo de 0,2 ml | Proveedor de laboratorio general | ||
| de 1,5 ml proveedor de | laboratorio | ||
| general QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | o ADN |
| ligasa T4 equivalente | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 T4 T4 Tampón de reacción de ligasa | England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleótido | proveedor de laboratorio | '-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' (Grado de purificación: SDS-PAGE) | |
| Proveedor de laboratorio general de oligonucleótidos de cadena negativa | '-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Grado de purificación: SDS-PAGE) | ||
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Tampón de corte H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platino Taq ADN Polimerasa de alta fidelidad | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | o equivalente |
| Grado PCR Proveedor | laboratorio general Termociclador | ||
| de 96 pocillos (con tapa calentada) | Proveedor | ||
| Linker Primer proveedor | laboratorio | 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Grado de purificación: grado PCR) | |
| MLV-3' Proveedor | laboratorio general | 5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Grado de purificación: grado PCR) | |
| cebador anidado del enlazador 454 | proveedor | 5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grado de purificación: SDS-PAGE) | |
| MLV-3' Imprimación anidada LTR 454 | proveedor | 5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grado de purificación: SDS-PAGE) | |
| cebador anidado del enlazador Illumina | proveedor | 5'-TCGTCGGCAGCGTGTGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grado de purificación: SDS-PAGE) | |
| MLV-3' Imprimación anidada LTR Illumina | proveedor | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grado de purificación: SDS-PAGE) | |
| Solución de acetato de sodio (3M) pH 5.2 | proveedor | ||
| Etanol (absoluto) para biología molecular | Sigma-Aldrich | E7023 | o equivalente |
| Topo TA Kit de clonación (con vector pCR2.1-TOPO) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Kit de extracción de gel | QIAGEN | 28704 | |
| Agarosa | Sigma-Aldrich | A9539 | o equivalente |
| Bromuro de etidio | Sigma-Aldrich | E1510 | o equivalente |
| Escalera de ADN de 100 pb | Invitrogen | 15628019 | o equivalente |
| 6x Tampón de carga | ThermoScientific | R0611 | o equivalente |
| NanoDrop 2000 Espectrofotómetro UV-Vis | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Kit de índice | Illumina | FC-131-1001 o FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Soporte magnético Dynal para tubos de 2 ml | Invitrogen | 12321D | o equivalente |
| Kit Agencourt AMPure XP 60 ml | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | de laboratorio | ||
| Agilent 2200 Sistema TapeStation | Agilent Technologies | G2964AA | o equivalente |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | o equivalente |
| D1000 Reactivos | Agilent Technologies | 5067-5583 | o equivalente |
| KAPA Library Quantification Kit para plataformas Illumina (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Sistema de PCR rápida en tiempo real | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular | proveedor | ||
| HT1 (tampón de hibridación) | Illumina | Incluido en el kit de reactivos MiSeq Kit | |
| reactivos MiSeq v3 (150 ciclos) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Sistema MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
Referencias
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet.
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Reimpresiones y permisos
