Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM

Resumen

Demostramos un método para la imagen de múltiples moléculas dentro de nano-estructuras heterogéneas con una sola molécula exactitud utilizando secuencial vinculante y elución de fluorescently marcó anticuerpos.

Resumen

La creación de imágenes de estructuras celulares heterogéneas mediante la microscopía de localización de moléculas individuales se ha visto dificultada por la precisión de localización y la capacidad de multiplexación inadecuadas. Utilizando marcadores fiduciales fluorescentes de nano-diamante, describimos los procedimientos de corrección y alineación de deriva requeridos para obtener alta precisión en microscopía de localización de molécula única. Además, se describe una nueva estrategia de multiplexación, madSTORM, en la que se dirigen múltiples moléculas en la misma célula usando unión secuencial y elución de anticuerpos fluorescentes. MadSTORM se demuestra en una célula T activada para visualizar las ubicaciones de los diferentes componentes dentro de una membrana-bound, multi-proteína estructura llamada el microcluster de células T receptor. Además, se discute la aplicación de madSTORM como una herramienta general para la visualización de estructuras multi-proteína.

Introducción

Se han desarrollado una variedad de técnicas de microscopía de super resolución para superar el límite de difracción de la microscopía óptica (~ 200 nm). Entre éstas se encuentra una categoría de técnicas denominadas microscopía de localización de moléculas individuales (SMLM) que incluye microscopía de localización por fotoactivación (PALM) y microscopía óptica de reconstrucción estocástica (STORM). Las técnicas SMLM comparten el uso de fluoróforos que pueden ser conmutados entre los estados (fluorescente) y apagado (oscuro / foto-conmutado), permitiendo la localización secuencial de la fluorescencia de las moléculas individuales ^{1 ,}

Protocolo

Precaución: Antes de usar, consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) pertinentes. Varios de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos y carcinógenos. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando realice el protocolo, incluyendo el uso de controles de ingeniería (campana extractora de humos, guantera) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados).

1. Imágenes multiplexadas de células T activadas

1. Directamente conjugar los anticuerpos con Alexa-647 (A647) colorante utilizando el Alexa 647 kit de ma....

Resultados

Se utilizó el método secuencial de elución y tinción para producir la imagen madSTORM multiplexada de microclusters y otras estructuras en una célula T de Jurkat activada ( Figura 1 , alineaciones de figuras de comprobación). Cada imagen pseudo-coloreada representa una ronda de formación de imágenes madSTORM adquirida en los pasos 1.1.1 a 1.3.13. Como se ha descrito anteriormente ¹⁰ , el campo de visión debe ser monitorizado para dete.......

Discusión

Los procedimientos de multiplexación secuencial, corrección de deriva y alineación en madSTORM permiten una visualización precisa y altamente multiplexada de estructuras heterogéneas en células. ¹⁰ Además, madSTORM evita las limitaciones de la TORMENTA multicolor como la aberración cromática y las propiedades de fotosensibilización / emisión subóptimas de colorantes rojos no lejanos ^{9 , 12} . A medida que la etapa de elución reduce signifi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cámara de cubreobjetos de 8 pocillos	Lab-tek	155409
solución de poli-L-lisina al 0,1%	Sigma-Aldrich	P8920
NV-100 nm Nano-diamante fluorescente	Adamas	Red FND
anti-CD3 y épsilon; anticuerpo	BD Biosciences	555329
Albúmina sérica bovina, fracción V	KSE Scientific	98-100P
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
10% Paraformaldehído	EMS	15712	carcinógena
de piel de pescado de agua dulce	Sigma-Aldrich	G7041
Alexa 647 kit de etiquetado de anticuerpos	Thermo Fisher	A20186
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma-Aldrich	138924
PIPAS	Sigma-Aldrich	P6757
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M7154	Altamente tóxico, sensible al aire
Cisteamina	Sigma-Aldrich	30070	Altamente tóxico
Ciclooctatetraeno 98%	Sigma-Aldrich	138924	Altamente tóxico, sensible al aire
10x PBS	KD Médico	RGF-3210
10x TBS	KD Médico	RGF-3385

Gelatina