Meest voorkomende analyses van de inhoud van de darm van macroinvertebrates zijn visueel. Waarbij intensieve kennis over morfologische diversiteit van organismen van de prooi, ze missen zachte lijf prooi en, als gevolg van de sterke trimventilatoren van de prooi, zijn bijna onmogelijk voor sommige organismen, met inbegrip van vlokreeftjes. Wij bieden gedetailleerde, roman genetische methoden voor macroinvertebrate ten prooi identificatie in het dieet van vlokreeftjes.
Analyseren van voedsel webs is essentieel voor een beter begrip van de ecosystemen. Bijvoorbeeld kunnen voedselweb interacties ondergaan grote veranderingen veroorzaakt door de invasie van uitheemse soorten. Een nauwkeurige identificatie van veld van predator en prooi interacties is echter moeilijk in veel gevallen. Deze analyses zijn vaak gebaseerd op een visuele beoordeling van de inhoud van de darm of de analyse van stabiele isotopenverhoudingen (δ15N en δ13C). Dergelijke methoden vereisen uitgebreide kennis over, respectievelijk, de diversiteit van de morfologische of isotopische handtekening van individuele prooi organismen, wat leidt tot hindernissen in de nauwkeurige identificatie van prooi organismen. Zachte lijf prooi organismen, onderschatten visuele gut inhoud analyses vooral omdat maceratie, opname en vertering van prooi organismen identificatie van specifieke soorten moeilijk maken. Vandaar, polymerase kettingreactie (PCR) gebaseerde strategieën, bijvoorbeeld het gebruik van een groepspecifiek primer ingesteld, bieden een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van voedselweb interacties. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen om te onderzoeken van de darm-inhoud van macroinvertebrate consumenten uit het veld met behulp van groepsspecifieke primer sets voor nucleaire ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA kan worden geëxtraheerd hetzij uit hele monsters (in het geval van kleine taxa) of uit de inhoud van de darm van specimens verzameld in het veld. Aanwezigheid en functionele efficiëntie van de DNA-sjablonen moeten worden bevestigd vanuit de geteste persoon met behulp van universele primer ingesteld gericht op de respectieve subeenheid van DNA. We laten ook zien dat verbruikte prooi kan worden bepaald verder tot op het niveau van soorten via PCR met ongewijzigde groepsspecifieke inleidingen gecombineerd met latere enkele streng conformatie polymorfisme (SSCP) analyses met behulp van polyacrylamide gels. Bovendien laten we zien dat het gebruik van verschillende fluorescente kleurstoffen als labels kan parallelle screening voor DNA-fragmenten van verschillende prooi groepen uit meerdere inhoud monsters van de darm via geautomatiseerde fragment analyse.
Predator en prooi interacties, die de meerderheid van de trofische interacties en voedselweb dynamiek vormen, zijn belangrijke aspecten te karakteriseren de fluxen van materie en energie in de hele voedsel webs binnen en tussen de ecosystemen, die behoort tot de belangrijkste doelstellingen van ecologie 1. de bepaling van de bron en stroom van koolstof en voedingsstoffen is het bevorderen van het inzicht in ecologische verbinding tussen ecosystemen2. Echter, ecosystemen, zoals rivieren en hun stroomgebieden, zijn niet alleen gekoppeld door stromen van organisch materiaal en organische voedingsstoffen, maar ook door de bewegingen van organismen3. Dus, habitat wijzigingen onderbreking van de stroom van middelen die een link van deze systemen kunnen sterk veranderen de voedsel vliezen van beide ecosystemen, niet alleen rechtstreeks maar ook onrechtstreeks door het veranderen van de respectieve samenstelling van predator en prooi Gemeenschappen. Bijvoorbeeld, zijn wijzigingen van voedsel webs aangetoond moet worden gekoppeld aan de bewegingen van één predator soorten (bijvoorbeeld, regenboogforel)4. Dergelijke wijzigingen worden potentieel biodiversiteit en het functioneren van aquatische ecosystemen bedreigen. Daarom is analyseren van predator en prooi interacties in het veld essentieel voor het bepalen van de invloed van de mens veroorzaakte veranderingen in het milieu, zoals water managementpraktijken, op de inheemse biodiversiteit van aquatische ecosystemen.
Aangezien het bijhouden van trofische verbanden moeilijk in complexe systemen is, zijn verschillende benaderingen vastgesteld waarmee de beoordeling van het voederen van interacties in het veld5. Traditioneel, onderzoeken van het voederen van interacties in het veld zijn gebaseerd op visuele identificatie van prooi blijft in ontleed lef en vereist een uitgebreide kennis over morfologische prooi diversiteit. Visuele gut inhoud analyses hebben verstrekt inzicht in het gebruik van de hulpbronnen van verschillende groepen consumenten (bijvoorbeeld seizoensgebonden variatie in de voeding van kreeft6 en vis7,8 of voeding voorkeuren van roeipootkreeften). Echter het fysieke proces van spijsvertering visuele gut inhoud analyses bemoeilijkt en mist meestal zacht carrosserie prooi-organismen9. Voor soorten voeden door vloeibare inslikken of voor sommige ongewervelde consumenten die intensief Vermaal hun voedsel voor inslikken, zoals vlokreeftjes, is visuele identificatie van prooi soorten in de inhoud van de darm niet onmogelijk10. Vanwege deze beperkingen biedt moleculaire analyse een veelbelovend alternatief.
Moleculair analyses zijn geworden een gemeenschappelijk instrument waardoor de prooi van snelle en nauwkeurige detectie in de inhoud van de darm. Het bereik van dergelijke technieken is divers: strategieën op basis van monoclonal antilichamen of polymerase-kettingreactie (PCR) worden vaak gebruikt, vanwege hun hoge gevoeligheid en specificiteit11. De ontwikkeling van nieuwe monoclonal antilichamen is tijd – en kostenintensieve, daarom de toepassing van andere moleculaire technieken is nuttiger wanneer antilichamen11niet reeds bestaan. Een andere gemeenschappelijke benadering is de versterking van de regio’s van deoxyribonucleic acid (DNA), zoals ribosomal RNA acid (RNA) genen aanwezig zijn in de meeste soorten, met behulp van universele primer ingesteld12,,13. Wanneer u deze techniek gebruikt, is het vaak niet mogelijk om te identificeren van het hele scala van prooi organismen in gemengde bronnen van DNA14. Een effectieve aanpak om te voorkomen dat de teruggave is groepsspecifieke primer gebruiken wordt ingesteld voor genetische gut inhoud analyses. Ontworpen om te versterken alleen DNA regio’s van bijzondere doelgroepen en uitsluiten van alle andere soorten15,16, inschakelen groepsspecifieke inleidingen identificatie van prooi organismen op het taxonomische niveau van de opgegeven groepen zonder tijd – en kostenintensieve secundaire analyses. Zoals alle inhoudsanalyse gut, evenwel dergelijke analyses slechts een momentopname van het voederen van gedrag. Daarom, moleculaire gut inhoud analyses combineren met analyses van integratie van de tijd natuurlijke traceurs (bijvoorbeeld stabiele isotopen) wordt beschouwd als gunstig1,2.
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor PCR-gebaseerde onderzoek van predator en prooi interacties met behulp van groepsspecifieke primer sets voor nucleaire ribosomal DNA (rDNA) regio’s worden gecombineerd met stabiele isotoop analyses van het hetzelfde model. We beschrijven de opsporing van het DNA van één prooi groepen via agarose gelelektroforese. Daarnaast presenteren wij gelegenheid voor verder stroomafwaarts analyses van PCR producten van dergelijke groepsspecifieke inleidingen die van toepassing zijn wanneer een hogere taxonomische resolutie dan de inleidingen specificiteit vereist is. Omdat één gestrande DNA (ssDNA) tertiaire conformaties vorm die wordt bepaald door hun primaire reeks17 fragmenten, leiden kleine variaties in fragmenten versterkt door dergelijke groepsspecifieke inleidingen tot conformationele veranderingen. Dergelijke veranderingen kunnen worden gedetecteerd door enkele streng conformatie polymorfisme (SSCP) analyses met polyacrylamide gels17,18, waardoor een meer nauwkeurige identificatie van prooi organismen (tot op het niveau van de soorten).
Terwijl de Elektroforese van het gel van de agarose is een gemeenschappelijk en goedkope tool om DNA-fragmenten te visualiseren en bepalen hun lengte19, de resolutie is afhankelijk van de hoeveelheid DNA en de kleuring kleurstof gebruikt20. Meestal de visualisatie is ongecompliceerd bij het werken met zuivere DNA-monsters, maar potentieel lage bedragen van havikachtigen DNA in de inhoud van de darm van de consument kan bemoeilijken het scoren van agarose gel elektroforese resultaten. Nog, deze detectiemethode is haalbaar is om het scherm van een laag aantal consument exemplaren van het veld voor een of een paar prooi groepen, maar complicatie in het scoren maakt de screening van een groot aantal monsters voor meerdere prooi taxa tijd uiterst intensieve en dus onuitvoerbaar. Een meer gevoelige detectiemethode is de geautomatiseerde analyse van fragmenten via capillaire elektroforese, waarmee bovendien de bepaling van de exacte lengte van fragmenten21. Verschillende microsatelliet gebaseerd studies hebben aangetoond dat met behulp van verschillende fluorescente kleurstoffen als labels, het mogelijk is om te ontdekken en bepalen verschillende fragmenten van vergelijkbare lengte door geautomatiseerde fragment analyse22,23, 24. Daarom ook presenteren we een gedetailleerd protocol voor parallelle opsporing van DNA van meerdere prooi groepen met behulp van PCR met gelabelde groepsspecifieke primer sets en detectie via geautomatiseerde fragment analyse met een geautomatiseerde sequencer. Daarnaast presenteren wij de resultaten van een case studie waaruit blijkt dat de detectie van prooi DNA via geautomatiseerde fragment analyse een aanpak waarmee ook een relatieve kwantificering van geconsumeerde prooi.
Hier presenteren we een gemakkelijke en kosten-efficiënte methode voor PCR-gebaseerde bepaling van predator en prooi interacties van veldmonsters via groepsspecifieke inleidingen voor rDNA regio’s, die kunnen worden gecombineerd met andere niet-moleculaire analyses van de dezelfde specimens. Er zijn echter verschillende kritische stappen binnen het protocol. Ten eerste, het verzekeren van de specificiteit van de inleidingen gebruikt is essentieel. Ten tweede, is het voorkomen van verontreiniging en verlies van gut inhou…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Silke Classen van het onderzoeksinstituut voor ecosysteem analyse en beoordeling (gaiac), RWTH Aachen voor haar bijstand bij de opstelling van de in dit protocol gebruikte groepsspecifieke primer-sets. Wij danken Peter Martin en Laura Schynawa van de Universiteit van Kiel voor de samenwerking in het water mijten experimenten. Wij danken ook de assistenten van de technische lab om het lab soepel en het voorbereiden van het register van bedrijven en de catalogus nummers. Dit werk werd gesteund door de Duitse Research Foundation (DFG; project GE 2219/3-1).
liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
1.5 ml reaction tubes – Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
fuzz-free paper towel | Any | NA | |
Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
Heating Thermoshaker | Any | NA | |
Vortex Mixer | Any | NA | |
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
Microwave | Any | NA | |
Conical flask | Any | NA | |
Measuring cylinder | Any | NA | |
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
Beaker | Any | NA | |
RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
Separation Gel – LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |