Detección sistema para la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación celular de células de Glioblastoma de drogas basados en citometría flujo

Summary

Se presenta un protocolo de investigación eficiente para la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación astroglial en células de glioblastoma (GSCs). El ensayo se basa en un reportero de la diferenciación de células madre por el que la expresión de la GFP mejorada (eGFP) es conducida por el promotor humano de GFAP.

Abstract

Glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral primario más común y más mortal en los adultos, que causa aproximadamente 14.000 muertes cada año en los Estados Unidos solamente. Mediana de supervivencia tras el diagnóstico es menos de 15 meses con máxima quimioterapia temozolomida, la radiación y la resección quirúrgica. Los retos inherentes en el desarrollo de tratamientos más eficaces de GBM se han convertido en cada vez más evidente e incluyen su invasividad inflexible, su resistencia a los tratamientos estándar, su complejidad genética y molecular adaptabilidad y subpoblaciones de GBM células fenotípicas similares a células normales, en este documento se denomina células de glioblastoma (GSCs). Porque GSCs se necesitan para la progresión y el crecimiento del tumor, terapia basada en la diferenciación representa una modalidad de tratamiento viable para estas neoplasias incurables.

El siguiente protocolo describe una colección de procedimientos para establecer un alto rendimiento de cribado plataforma destinada a la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación astroglial de GSC. En el núcleo del sistema es una proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) diferenciación reportero. El protocolo contiene los siguientes procedimientos generales: (1) establecer diferenciación de GSC reportero líneas; (2) pruebas/validación de la pertinencia de la reportera a la capacidad de auto-renovación/clonogenic de GSC; y (3) alta capacidad-citometría de flujo basado en detección de drogas.

La plataforma de proyección proporciona un enfoque sencillo y de bajo costo para identificar pequeñas moléculas que promueven la diferenciación GSCs. Además, la utilización de bibliotecas de medicamentos aprobados por la FDA tiene el potencial para la identificación de agentes que pueda reutilizar más rápidamente. Además, se espera que terapias que promueven la diferenciación de células madre de cáncer funcionan en forma sinergística con las actuales terapias "estándar de atención" que han demostrado para atacar y eliminar las células de cáncer diferenciado principalmente más.

Introduction

Estudios recientes han demostrado que los tumores contienen una pequeña población de células, como las células madre cancerosas (CSCs) o las células iniciadoras del tumor, que son responsables de la progresión tumoral, metástasis y resistencia a la quimio y radio terapias ^{1, 2}. la presencia de células madre del cáncer y su progenie más diferenciado dentro de los tumores se considera importante promover la heterogeneidad intratumoral y representa un obstáculo importante en el tratamiento de cáncer³. Jerarquía de célula tumoral, proporcionado por la teoría de la célula de vástago del cánc....

Protocol

Nota: Astroglial y lentivirus neuronal reportero sistemas fueron comprados como preparaciones lentivirales pre-empacados, concentradas. Se requiere conocimientos básicos de la técnica de citometría de flujo. También, para un uso completo de este protocolo, el usuario tendrá acceso a un citómetro de flujo con capacidad de alto rendimiento (acepta placas de 96 pocillos como fuente de la muestra).

1. sistema reportero transcripcional lentivirales

Nota: En los análisis de citometría de flujo, utilice células parentales, no-transduced, o vector-transduced (no fluorescente) para establecer la fluorescencia basal. También....

Results

Tres líneas de neuroesferas derivadas de paciente independiente transduced con el reportero de astroglial lentivirus codifican para una proteína verde fluorescente (GFP) fundida en la estructura con cintas de resistencia Zeocin y conducidas por el elemento humano de promotor GFAP ( Figura 1). Siguiente clones individuales fueron aislados por placas 0,7 células por pocillo en una placa bien 96 (figura 2), esto fue seguido por la d.......

Discussion

Mientras la mayoría de los estudios previos de GSCs centrados principalmente en los marcadores que los definen, en este estudio se decidió adoptar el enfoque inverso. Nos centramos principalmente en las progenies diferenciadas generadas GSCs (p. ej., células expresan marcadores neuronales y astroglial). Aquí se demuestra la utilización de un sistema, que se basa en la expresión humana de promotor dependiente GFAP de GFP de detección de drogas basadas en células de alto rendimiento. Todos los experimentos se realizaron ut.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS (Solución salina equilibrada de Hank)	Sigma Aldrich	H6648
Reportero de diferenciación GFAP humano (pGreenZeo, Virus)	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
reactivo desechable estéril de 50 ml embalses	Corning	4870
placa de 6 pocillos	Thermo Fisher Scientific	130184
placa de 96 pocillos	Falcon	353072
Biolite T25 cm² Matraz ventilado	Thermo Fisher Scientific 130189
Biolite T75 cm² Matraz ventilado	Thermo Fisher Scientific	130190
15 ml Tubos de centrífuga	Celltreat	229411
1,5 ml Tubos de microcentrífuga	Fisher Scientific	05-408-129
Ovation Pipeta multicanal, 12 canales, 0,5 - 20 uL	VistaLab Technologies	1060-0020
Ovation Pipeta multicanal, 12 canales, 5-250	uL VistaLab Tecnologías	1060-0250
Puntas de pipeta multi 12 canales 25 μ l	VistaLab Technologies	4060-1002
Puntas de pipeta multi 12 canales 250 μ l	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT Citómetro de flujo de sobremesa	EMD Millipore	0500-4005
Colecciones clínicas de los NIH 1 y 2 bibliotecas de moléculas pequeñas	Evotec
Name	Company	Número de catálogo	>Comments
Para la preparación de medios de células madre neurales (500 mL)			Concentración final
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0.20%
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
Heparina sal sódica	Sigma Aldrich	H3149	0.0002%
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5.4 mM
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14.5 mM
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) 100X	Gibco	15140-122	1X
Progesterona	Sigma Aldrich	P8783	16 nM
Putrescina	Sigma Aldrich	P5780	4.8 y micro; M
Basic FGF (FGF2),	Oro HumanoBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF, Oro HumanoBio		1150-04-100	20 ng/ml
Filtro de Botella, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	Úselo para filtrar medios de esterilización