QA-1 (HLA-E en humanos) pertenece a un grupo de moléculas de histocompatibilidad no clásicas complejas 1b. Inmunización con epítopos de Unión-1-control de calidad se ha demostrado para aumentar la regulación inmune del tejido específico y mejorar varias enfermedades autoinmunes. Adjunto describimos una estrategia de biblioteca de péptidos superpuestas para la identificación de los epitopos de Qa-1 en una proteína.
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Artículo de método
Biblioteca de péptido superpuestas a epitopos Qa-1 en una proteína
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Resumen
Resumen
QA-1 (HLA-E en humanos) pertenece a un grupo de 1b complejo mayor de histocompatibilidad no clásicas moléculas (MHC-Ib). Los datos recientes sugieren que las moléculas de Qa-1 desempeñan papeles importantes en topografía las células para la integridad estructural y funcional, induciendo la regulación inmune y limitar las respuestas inmunes a las infecciones virales. Además, el aumento funcional de CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células a través del epítopo inmunización ha demostrado efectos terapéuticos en varios modelos animales de enfermedad autoinmune, por ejemplo, encefalomielitis alérgica experimental, artritis inducida por colágeno y la diabetes no obesos. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de un método que puede eficientemente y rápidamente identificar epítopos de Qa-1 funcionales en una proteína. Aquí, describimos un protocolo que utiliza CD8 restringidas de 1 Qa+ T cell líneas específicas para una biblioteca de péptidos (LPO) superpuestas para determinar Qa-1 epitopos en una proteína. Esta biblioteca OLP contiene péptidos traslapados 15-mer que cubren toda la longitud de una proteína y péptidos adyacentes se superponen por 11 aminoácidos. Mediante este protocolo, se identificaron recientemente un epítopo de Qa-1 9-mer en la glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG). Este epítopo MOG Qa-1 recién asignada fue demostrado para inducir CD8 específicos del epítopo, restringido a Qa-1+ T las células que mayor regulación inmune específicos de mielina. Por lo tanto, este protocolo es útil para la investigación futura de nuevos objetivos y funciones de CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células.
Introducción
QA-1 pertenece a un grupo de 1b complejo mayor de histocompatibilidad no clásicas moléculas (MHC-Ib) en ratones. Su homólogo humano es HLA-E. Pruebas anteriores se ha demostrado que moléculas de Qa-1 funciones biológicas importantes. En primer lugar, las moléculas Qa-1 juegan un papel importante en la topografía de las células para la integridad estructural y funcional. En este sentido, Qa-1 moléculas han desarrollado varias estrategias para controlar la función normal de una célula. Una estrategia de este tipo permite Qa-1 moléculas para formar complejos con un péptido líder procesados (epitope), es decir, el control de calidad-1 determinante modificador (Qd....
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron en cumplimiento de una institucional Animal cuidado y Protocolo de uso aprobado por el cuidado Animal y uso de la Universidad de Texas en El Paso y la Universidad de Loma Linda.
1. generación de una biblioteca de LPO que abarca toda la longitud de una proteína
- Diseño de una biblioteca de la OLP en el que los péptidos son 15-mer en longitud y péptidos adyacentes se superponen por 11 aminoácidos.
Nota: En el estudio de la OLP MOG, secuencia del precursor del MOG [Mus musculus] fue obtenido de la base de datos NCBI proteína siguiendo este enlace: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944....
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Resultados
Diseño de una biblioteca de LPO que abarca toda la longitud de una proteína
Empezando por el N-terminal de una proteína, cada péptido es 15 aminoácidos (15-mer). Por lo tanto, el primer péptido abarca posición 1 a la posición 15. El N-terminal del péptido segunda se superpone con el c-terminal del péptido primero por 11 aminoácidos. Por lo tanto, el segundo péptido abarca la posición 5 a la posición 19. Diseñar el resto de los pépt.......
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Discusión
Aquí, hemos descrito un protocolo para el análisis Qa-1 epitopos en una proteína. En relación con este protocolo, varias otras estrategias también fueron divulgados previamente. Primero, trasplante allogeneic CD8+ líneas celulares T y clones fueron utilizados para la identificación del Qdm1. En segundo lugar, un motivo de Unión Qa-1 supuesto del análisis de Qdm fue utilizado para la identificación de la HSP60p216-224 y TCRBV8.1 del epítopo9,
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Divulgaciones
Autores no declaran ningún conflicto de interés.
Agradecimientos
Agradecemos a Penelope Garcia por su asistencia técnica y la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca de innovación de investigación (RIG) desde el Departamento de medicina en la Universidad de Loma Linda (681205-2967) y una donación de piloto de la National Multiple Sclerosis Society (PP1685) para XT.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| La proteína a analizar | N/A | N/A | La secuencia de la proteína se puede obtener del NCBI |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO debe ser estéril y se debe analizar el cultivo celular. |
| Ratones Kb-/-Db-/- | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | Utilizamos ratones Taconic H2-KbH2-Db doube (Cat#: 4215-F y 4215-M) que, sin embargo, ya no están disponibles. |
| Medio sin suero AIM V ThermoFisher | Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoetanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Aminoácidos no esenciales | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Kit | de aislamiento positivoThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Solución balanceada de fosfato (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| pipeta Trasfer | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| Placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos | EE. UU | . #: CC7682-7548 | |
| Placas de pocillos múltiples tratadas con TC de Corning Costar, 96 pocillos, fondo en forma de V | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml de profundidad Placa de PP de 06 pocillos, estéril | EE. UU | .#: 1896-1110 | |
| IL-2 murino recombinante | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| IL-7 murino recombinante | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Captura anti-IFN-γ anticuerpo | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| placa ELISPOT | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R. Qa-1b | Hecho a medida (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Vector lentiviral Qa-1 | GeneCopoeia | Producto#: Mm02955 | |
| Detección anti-IFN-& | anticuerpo BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Estreptavidina-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| Sustrato AEC | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| Analizador | ImmunoSpot ImmunoSpot | Cualquier analizador inmunoSpot |
Referencias
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H.
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Reimpresiones y permisos
