Nos ilustran un método directo para derivar macrófagos murinos primarios de células de médula ósea y conjuga un método sencillo para preparar ácidos grasos BSA. Entonces demostramos que ácidos grasos saturados puede inducir la muerte celular de macrófago, y tal muerte celular está positivamente asociada con la acumulación celular de los niveles de ceramida.
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Artículo de método
Ácidos grasos saturados inducir muerte celular de macrófago asociado de ceramida
En este artículo
Resumen
Resumen
Los macrófagos expresan muy epidérmica proteína de unión a ácidos grasos y la proteína de unión a ácidos grasos adiposa. Se activa la absorción saturada y ácidos grasos insaturados, que podría desempeñar un papel crítico en la regulación de sus funciones inmunes. Numerosos estudios han demostrado que diversos ácidos grasos, saturados o insaturados, poseen diferentes efectos sobre el crecimiento celular y la función. Sin embargo, varían los enfoques utilizados para la preparación de ácido graso que puede conducir a resultados no fisiológicos. Albúmina sérica, un portador natural de ácidos grasos en sangre periférica de mamífero, se recomienda para la formación de un conjugado complejo con la sal de sodio de los ácidos grasos para estudiar la función del ácido graso en células de mamífero, minimizando la toxicidad del jabón de ácido graso. Así, una sencilla, relativamente rápida de la calefacción y sonicando método es desarrollada y presentada aquí para la formación del conjugado ácida grasos BSA. Se describe un protocolo de uso de ácidos grasos saturados, especialmente el esteárico ácidos para inducir muerte celular severa en macrófagos derivado de médula ósea de ratón. Demostramos más que la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados está positivamente asociada con los niveles de ceramida celulares acumulados. Este método se puede extender para los estudios del impacto de los ácidos grasos en las células de otros mamíferos.
Introducción
Los ácidos grasos juegan un papel crítico en el metabolismo energético y en la síntesis de fosfolípidos de membrana en diferentes tipos de células. Los ácidos grasos tienen una solubilidad acuosa baja. Preparación apropiada de ácidos grasos es de vital importancia para el estudio de las funciones biológicas de los ácidos grasos en las células mamíferas. Cuando los ácidos grasos se preparan con etanol, muchos ácidos grasos pueden mostrar su efecto tóxico jabón (detergente) en la membrana celular, incluso en concentraciones relativamente bajas de1. Como un natural, importante transportador de ácidos grasos libres en el suero, la albúmina sérica s....
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Protocolo
el protocolo fue aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Louisville.
1. macrófagos de derivados de la médula ósea de ratón (BMDMs)
- Euthanize un ratón de tipo salvaje de 6 a 8 semanas de edad, sano con CO 2. Perno hasta un tablero de la espuma y spray con etanol al 70% hasta que se haya empapado. Quitar los huesos tibia/fémur con pinzas y tijeras. Ponerlos en una placa Petri con 5 mL 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Realizar todos los procedimientos bajo condiciones estériles.
- Corte ambos extremos del hueso fémur tibia con una tijera en una cam....
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Resultados
La obesidad aumenta las concentraciones de ácidos grasos libres en suero. Como fagocitos profesionales, macrófagos activamente toman ácidos grasos para mantener la homeostasis de host. Durante estos procesos, sobrecarga de lípidos pueden inducir muerte celular de macrófago. Para ello, cultiva BMDMs en vitro con obesos niveles de ácidos grasos dietéticos y muerte de las células macrófagos medido utilizando tinción de citometría de flujo. En comparación con el control de la BSA, ác.......
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Discusión
La preparación adecuada de solución de ácido graso es de vital importancia para el estudio de la función biológica de los ácidos grasos. La neutralización de los ácidos grasos aumenta su solubilidad en la solución acuosa. Sin embargo, sales de sodio de ácidos grasos, especialmente los ácidos grasos saturados, son todavía de baja solubilidad en agua o PBS como observado. Un método es utilizar el etanol del 95-100% para ayudar a disolver ácidos grasos1. Usando este método, mayor toxicidad para las c.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no hay conflictos de intereses financieros.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado parcialmente por los fondos de puesta en marcha de la Universidad de Louisville y el Instituto Nacional del cáncer (Bethesda, MD) concede a R01CA177679, R01CA180986.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Baño ultrasónico CPX | Bransonic | Modelo 2800 | |
| Palmitato de sodio (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Estearato de sodio (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Albúmina sérica bovina (BSA), libre de ácidos grasos | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Factor estimulante de colonias de macrófagos de ratón (mM-CSF) | Tecnología de señalización celular, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Anexina V, Alexa Fluor 488 conjugado | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Anticuerpo monoclonal anti-ceramida (IgM de ratón) | Sigma | C8104-50TST | Clon: MID 15B4 |
| Anticuerpo IgM anti-ratón de cabra, y micro; cadena, FITC conjugado | Sigma | AP128F | |
| Tampón de fijación | Biolegend | 420801 | |
| Tampón de permeabilización | Ebioscience | 4307693 | |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Sigma | ||
| 556454 | Biosciences | ||
| L929 ATCC | CCL-1 | ||
| Corning Elevador de células | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Nota: M.W. es para peso molecular. |
Referencias
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S.
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Reimpresiones y permisos
