Summary

חומצות שומן רוויות לגרום מוות תאי מקרופאג Ceramide-הקשורים

Published: October 31, 2017
doi:

Summary

אנחנו להמחיש שיטה ישר קדימה כדי להפיק מאתר ראשי מקרופאגים מתאי מח עצם, שיטה פשוטה להכנת BSA-חומצות conjugates. ואז נדגים כי חומצות שומן רוויות יכול לגרום מוות תאי מקרופאג, כגון מוות של תאים קשורה באופן חיובי הסלולר הצטברות ceramide רמות.

Abstract

מקרופאגים לבטא מאוד אפידרמיס חומצת שומן מחייב חלבון ואת אדיפוז חומצת שומן מחייב חלבון. הם באופן פעיל ספיגת רווי, חומצות שומן בלתי רוויות, אשר עשויים לשחק תפקיד קריטי בוויסות פונקציות החיסונית שלהם. מחקרים רבים הראו כי חומצות שומן שונות, רווי או במאי רוויים, בעלי השפעות שונות על צמיחת תאים ותפקוד. עם זאת, הגישות המשמש להכנת חומצת שומן משתנים, אשר עלול להוביל לתוצאות שאינן-פיזיולוגיים. אלבומין, נשאית הטבעי של חומצות שומן בדם היקפי יונקים, מומלצת ויוצרים את המספר המשלים מורכבים עם מלח הנתרן של חומצות שומן כדי לחקור פונקציה חומצת שומן בתאי יונקים, ובכך לחסוך הרעילות של חומצת שומן סבון. לפיכך, פשוט, מהיר יחסית חימום, sonicating שיטה שפותחה, המובאת כאן על היווצרות תרכיב חומצה BSA-שומן. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות חומצות שומן רוויות, חומצות סטארית במיוחד כדי לגרום מוות תאי חמור ב העכבר מח נגזר מקרופאגים. נדגים בהמשך כי מות תאים הנוצרות על-ידי חומצות שומן רוויות קשורה באופן חיובי ceramide הסלולר שהצטברו רמות. בשיטה זו ניתן להרחיב ללימודי ההשפעה של חומצות השומן בתאי יונקים אחרים.

Introduction

חומצות שומן לשחק תפקיד חיוני לחילוף חומרים של אנרגיה, הסינתזה של קרום phospholipids סוגים שונים של תאים. חומצות שומן יש המסיסות מימית נמוכה. הכנה מתאימה של חומצות שומן יש חשיבות קריטית ללמוד על תפקודים ביולוגיים של חומצות שומן בתאי יונקים. כאשר חומצות שומן מוכנים עם אתנול, חומצות שומן רבים עשוי להראות השפעתם רעילים סבון (דטרגנטים) על קרום התא, אפילו בריכוזים נמוכים יחסית1. בתור נהג טבעי, רס ן עבור חומצות שומן בחינם בהסרום, אלבומין נחשב נשאית טוב של חומצת שומן משלוח במבחנה חומצת שומן פונקציה מבחני2,3,4. עם זאת, הפרטים של הכנת המספר המשלים חומצת שומן, אלבומין בדרך כלל אינם זמינים אף-על-פי פורסמו עבודות מחקר רבות באמצעות חומצות שומן.

מקרופאגים לבטא מאוד אפידרמיס חומצת שומן מחייב חלבון ואת אדיפוז חומצת שומן מחייב חלבון5,6,7,8. הם באופן פעיל ספיגת רווי, חומצות שומן בלתי רוויות אשר ייתכן לווסת פונקציות החיסונית שלהם. לחקור את ההשפעה של חומצות שומן על מקרופאגים ותאים אחרים, שיטות שונות של הכנת חומצות שומן היו יישומית1,7,9. באמצעות חומצת שומן מוכן כראוי/סרום אלבומין conjugates לחקור את ההשפעה של חומצות השומן על תפקוד מקרופאג יש חשיבות קריטית בקבלת נתונים משמעותיים מבחינה ביולוגית. מחקרים על ההשפעה של חומצות השומן על תפקוד מקרופאג יכול לספק ידע בסיסי פוטנציאלים טיפולית הנוגעים מטבוליזם חומצות שומן מעורב מקרופאג מחלות.

Protocol

הפרוטוקול אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת לואיוויל. 1. עכבר מח עצם נגזר מקרופאגים (BMDMs) Euthanize עכבר 6 עד 8-בת, בריא פראי סוג באמצעות CO 2. להצמיד אותו למטה לוח קצף, תשפריץ עם אתנול 70% עד שהכל רטוב. הסר את עצמות השוקה/עצם הירך עם מלקח…

Representative Results

השמנת יתר מגדילה את ריכוז חומצות השומן החופשיות בנסיוב. כמו המקצועי phagocytes, מקרופאגים פעיל לקחת את חומצות השומן כדי לשמור על הומאוסטזיס המארח. במהלך תהליכים אלה, ליפידים עומס יתר עלול לגרום מוות תאי מקרופאג. לשם כך, אנו תרבותי BMDMs במבחנה עם רמות מהשמנת יתר של חומצות שו?…

Discussion

הכנה נכונה של חומצת שומן פתרון יש חשיבות קריטית כדי ללמוד את התפקוד הביולוגי של חומצות שומן. הניטרול של חומצת שומן מעלה מסיסות שלה ב תמיסה מימית. עם זאת, מלחי נתרן של חומצות שומן, בעיקר חומצות שומן רוויות, הן עדיין של מסיסות נמוכה במים או PBS הבחנו. שיטה אחת היא להשתמש אתנול 95-100% כדי לסייע לפזר …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי ראשונית אוניברסיטת לואיוויל ומענקים המכון הלאומי לסרטן (בת’סדה, מרילנד) R01CA177679, R01CA180986.

Materials

CPX Ultrasonic Bath  Bransonic Model 2800
Sodium palmitate (PA) Nu-Chek Prep, Inc. S-1109 M.W. 278
Sodium stearate (SA) Nu-Chek Prep, Inc. S-1111 M.W. 306
Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free Fisher Scientific 9048-46-8
Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)  Cell Signaling Technology,  Inc. 5228
RPMI 1640 VWR International 71002-878
Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate Fisher Scientific A13201
7-AAD BD Biosciences 559925
Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) Sigma C8104-50TST Clone: MID 15B4
Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate Sigma AP128F
Fixation buffer Biolegend 420801
Permeabilization buffer Ebioscience 4307693
Red Blood Cell Lysis Buffer  Sigma 11814389001
Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 556454
L929 cells ATCC CCL-1
Corning Cell Lifter  Fisher Scientific 07-200-364
Note: M.W. is for molecular weight.

Referencias

  1. Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
  2. Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
  3. Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
  4. Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
  5. Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
  6. Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
  7. Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
  8. Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
  9. Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
  11. Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
  12. Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).

Play Video

Citar este artículo
Zhang, Y., Hao, J., Sun, Y., Li, B. Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death. J. Vis. Exp. (128), e56535, doi:10.3791/56535 (2017).

View Video