Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Resumen

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal e intracelular. Aquí describo un protocolo para el análisis del transporte axonal e intraflagelar en C. elegansy grabación en vivo .

Resumen

Transporte axonal y el Transporte intraflagelar (IFT) son esenciales para la función y la morfogénesis axon y cilios. Proteínas del superfamilia de quinesina y dineína son motores moleculares que regulan anterograde y retrógrada transporte, respectivamente. Estos motores utilizan redes de microtúbulos como rieles. Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo de gran alcance para estudiar transporte axonal y IFT en vivo. Aquí describo un protocolo para observar el transporte axonal y IFT en la vida del C. elegans. Transporte de carga puede visualizarse por selección de proteínas de carga utilizando proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP). C. elegans es transparente y proteínas GFP-tagged carga pueden expresarse en células específicas bajo promotores específicos de la célula. Gusanos vivos pueden ser fijos por microesferas en gel de agarosa de 10% sin matar o anestesiar los gusanos. En estas condiciones, movimiento de carga se puede observar directamente en los axones y cilios de la vida de C. elegans sin disección. Este método puede ser aplicado a la observación de cualquier molécula de carga en las células mediante la modificación de las proteínas de la blanco o las células que expresan. Proteínas básicas como motores moleculares y proteínas adaptadoras que intervienen en el transporte axonal y IFT se conservan en C. elegans. Comparado con otros organismos modelo, mutantes pueden ser obtenidos y mantiene más fácilmente en C. elegans. Combinando este método con varios mutantes de C. elegans puede aclarar los mecanismos moleculares del transporte axonal y IFT.

Introducción

Proyección de imagen de células vivas es una herramienta esencial para el análisis de transporte intracelular. En biología de la célula neuronal, análisis de transporte axonal con proyección de imagen de células vivas son esenciales para la comprensión de la función y la morfogénesis neuronal¹. Defectos en el transporte axonal subyacen varios neurodegenerativas trastornos². Dynein y proteínas de Kinesin Superfamilia realicen transporte axonal anterogradely y retrogradely, respectivamente^1,2.

Cilios son otro compartimento celular en el ....

Protocolo

1. preparación de la muestra

1. generar un transgénico C. elegans cepa de interés utilizando metodologías transgénicas ¹⁸. Por otra parte, obtener cepas adecuadas desde el centro de genética de Caenorhabditis (CGC). Para visualizar el transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica, utilice la línea transgénica wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] ⁷. Para observar el IFT, obtener la línea transgénica mnIs17 [osm-6::gfp] ¹⁹. Estas cepas se utilizan en el presente Protocolo.
   Nota: Ya sea matriz Extracromosómica, integraci....

Resultados

Transporte axonal de neuronas DA9
Utilizando la línea de wyIs251 , la anterógrada y el transporte axonal retrógrado de GFP::RAB-3 se puede grabar simultáneamente en la neurona de motor DA9. La velocidad media de anterograde y transporte retrógrado en el axón proximal dorsal de la neurona DA9 es aproximadamente 1,8 y 2,6 μm/s, respectivamente²². El número de vesículas móviles es 0.03 y 0.018 por μm del axón por s. Así, para una observaci.......

Discusión

Limitación con respecto a los métodos existentes
El método descrito aquí está optimizado para observar eventos rápidas como transporte axonal y IFT. Así, la inmovilización se priorice más de incubación más largo. Aunque hemos podido observar eventos de tráfico por al menos 20 min sin perturbación significativa, este método no sea siempre conveniente observar eventos lentos que requieren más observaciones, como la elongación del axón y migración celular. Para más observaciones, es necesario optimizar l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vidrio deslizante (76 x 26 mm)	Matsunami	S1111
Vitrina (22 x 40 mm)	Matsunami	C024401
Agarosa	Wako	318-01195
Microesferas de poliestileno 0,1 micras	Polysciences	#00876
Bloque de calor	TAITEC	0063288-000	CTU-mini
Microscopio	Microscopio de campo amplio	Olympus	IX-71
Escáner de disco giratorio	Yokogawa	CSU-X1	escáner confocal de disco giratorio
Cámara digital CCD	Hamamatsu Photonics	C10600-10B	Cámara CCD degital ORCA-R2
Objetivo (x100, NA1.4)	Olympus	UPLSAPO 100XO
Pipeta Pasteur (5 pulgadas)	IWAKI	IK-PAS-5P
Tubo de vidrio (1,5 cm de diámetro x 10,5 cm)	IWAKI	9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251	Laboratorio de Kang Shen	N/A
OTL11: mnIs17	Ref. 27, 29	N/A	SP2101 fue retrocruzado con tipo salvaje por 6 veces
Microscopio estereoscópico	Carl Zeiss	435064-9000-000	STEMI 508
Unidad de transiluminación de espejo	Carl Zeiss	435425-9010-000
alambre de platino (0,2 mm)	Nilaco Corporation	m78483501
plato de plástico de 60 mm	Falcon	#351007
Fiji	N/A	N/A
medio de crecimiento de nematodos (NGM)			1,7% (p/v) de agarosa, 50 mM de NaCl, 0,25 % (p/v) de peptona, 1 mM de CaCl2, 5 mg/mL de colesterol, 25 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4

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