Este protocolo describe el uso de un dispositivo microfluídico automatizado personalizable para visualizar la formación de biopelículas de Candida albicans en condiciones fisiológicas de host.
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Artículo de método
Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado
En este artículo
Resumen
Resumen
Candida albicans es el hongo más común patógeno de seres humanos, causando aproximadamente el 15% de los casos de sepsis adquirida en el hospital. Un atributo importante de la virulencia de C. albicans es su capacidad de forma biofilms, comunidades estructuradas de células a superficies bióticas y abióticas. Pueden formar biopelículas de C. albicans en los tejidos del anfitrión, como capas de mucosa y en dispositivos médicos, tales como catéteres, marcapasos, prótesis y prótesis mixtas. Biofilms plantean desafíos clínicos significativos ya que son altamente resistentes a las perturbaciones físicas y químicas y pueden actuar como reservorios a semilla habían diseminada infecciones. Varios ensayos en vitro se han utilizado para estudiar la formación de biopelículas de C. albicans , como ensayos de placa de microtitulación, mediciones de peso seco, ensayos de viabilidad celular y la microscopia confocal de exploración láser. Todos estos ensayos son ensayos de punto final único, donde se evalúa la formación del biofilm en un punto de tiempo específico. Aquí, describimos un protocolo para estudiar la formación de biopelículas en tiempo real usando un dispositivo microfluídico automatizado bajo condiciones de flujo laminar. Este método permite la observación de la formación de biopelículas, el biofilm se convierte con el tiempo, usando condiciones personalizables que imitan a los del huésped, tales como los encontrados en catéteres vasculares. Este protocolo puede utilizarse para evaluar los defectos de biofilm de mutantes genéticos, así como los efectos inhibitorios de agentes antimicrobianos en el desarrollo de biofilm en tiempo real.
Introducción
Candida albicans es un comensal miembro de la microbiota humana, sin embargo, es también un patógeno oportunista, capaz de causar infecciones fúngicas superficiales y graves1,2. Un rasgo importante de la virulencia de C. albicans es su capacidad de forma resistente y biofilms resistentes a los fármacos, comunidades de células adhirieron a una superficie y encerrado en una matriz extracelular de material1,3. Biopelículas de C. albicans son altamente estructurados, que contiene varias capas de varios tipos de células (alrededor....
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Protocolo
1. fungicidas de la célula cultura preparación
Nota: Cultivo de células de conducta trabajo (es decir, la abertura criogénicos stock tubos, tubos de cultivo celular y frascos) dentro de un gabinete de bioseguridad. Abra ultravioleta (UV) lámpara germicida al menos 1 h del gabinete antes de la obra y apagar la lámpara UV mientras trabajaba activamente en el gabinete. Utilizar guantes, gafas de seguridad y equipos de protección personal y descontaminar la superficie del Banco y pipetas con etanol al 70% antes del inicio del experimento. Se recomienda el uso de puntas de filtro estériles y familiaridad con técnicas microbiológicas asépticas bási....
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Resultados
Realizamos microfluídicos biofilm ensayo descrito aquí usando un tipo de salvaje cepa de C. albicans bajo condiciones de dos medios de comunicación (medios RPMI-1640 y araña), la cepa de tipo salvaje en presencia de los conocidos antimicóticos anfotericina B (16 μg/mL) en RPMI, y dos cepas mutantes previamente divulgados a tener defectos en la formación de biopelículas (bcr1Δ/Δ y efg1 Δ/Δ) en los medios de la araña.
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Discusión
El ensayo de biofilm microfluídicos personalizable aquí descrito permite la visualización de la formación de biofilm en tiempo real a un nivel unicelular cuando se expone a una tasa fija de flujo laminar y temperatura constante. Proporciona un medio poderoso para el desarrollo de biopelículas en cepas de tipo salvaje y mutantes, y los efectos de los tratamientos de agente antimicrobiano en biofilms bajo condiciones que imitan las condiciones fisiológicas observaron en entornos clínicos. A diferencia de la mayoría en .......
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Divulgaciones
Clarissa J. Nobile es uno de los fundadores de BioSynesis, Inc., una empresa de desarrollo de inhibidores y diagnósticos de C. albicans biofilms.
Agradecimientos
Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Nobile para discusiones útiles en ensayos de biofilm. Este estudio fue apoyado por los institutos nacionales de salud (NIH) subsidio AI125801 R21 (C.J.N.). D.L.R. fue apoyado por una Beca doctoral de la Universidad de California y el Instituto para México y los Estados Unidos (UC MEXUS) y el Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BioFlux 1000z | Fluxion | Dispositivo microfluídico automatizado para el análisis de células vivas | |
| Placa de 48 pocillos 0-20 dinas | Fluxion | 910-0047 | Placa microfluídica |
| Software de montaje | Fluxion Versión | 7.8.4.0 | Software de análisis de visualización |
| Software ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Extracto de levadura | Criterio | C7341 | |
| Bacto Peptona | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrosa (D-Glucosa) | Fisher Scientific | D163 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Caldo de nutrientes | Criterio | C6471 | |
| Difco D-manitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Anfotericina B | Corning | 30-003-CF | |
| Asas de inoculación estériles | VWR | 30002-094 | |
| Placas de Petri con tapa transparente | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Cubetas desechables | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Papel para lentes | VWR | 52846-001 | |
| Microplaca y cubeta espectrofotómetro | BioTek | EPOCH2TC | |
| incubadora agitadora | Eppendorf | M12820004 |
Referencias
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J.
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Reimpresiones y permisos
