Summary

Algılama ve miktar için Plasmodium falciparum içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi

Published: November 02, 2018
doi:

Summary

Burada, bir protokol için Plasmodium falciparum miktar virüslü sulu kırmızı kan hücrelerinde bir zayıflatılmış toplam yansıma kızılötesi Spektrometre ve çok değişkenli veri analizi kullanarak ve algılama mevcut.

Abstract

Biz miktar yöntemi ve parazitler ve sulu kırmızı kan hücrelerinde (RBCs) algılama çok değişkenli veri analizi () ile birlikte basit benchtop zayıflatılmış toplam yansıma Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spektrometresi kullanılarak göstermek MVDA). 3D 7 P. falciparum % 10 parasitemia yüzük sahne parazitler için kültürlü ve seri 0-1 arasında bir seyreltme oluşturmak için taze donör izole RBCs spike için kullanılan %. Her örneğinin 10 µL spektrum elde etmek için ATR elmas pencerenin ortasına yerleştirildi. Örnek verileri sinyal gürültü oranı artırmak için ve su katkısını kaldırmak için tedavi edildi ve sonra ikinci türev spektral özellikleri gidermek için uygulandı. Verileri daha sonra MVDA iki tür kullanarak analiz edildi: ilk asıl bileşen analizi (herhangi bir aykırı ve sonra kısmi en küçük kareler regresyon (PLS-R) miktar model oluşturmak için belirlemek için PCA).

Introduction

Sıtma bizim zaman en yıkıcı hastalıklar arasında olduğunu; endemik bölgelerde risk yarım nüfus yaşıyor ve orantısız yoksul1,2,3,4durumu. Sorunun büyük bir parçası asemptomatik taşıyıcılar ve toplumlarda kalıcı olması izin ve sivri enfeksiyon sırasında ıslak mevsim neden rezervuarlar için sivrisinek vektörel çizimler5, aracı olarak erken sahne hastalar var. Sıtma en ölümcül hastalık2en ağır formu neden P. falciparum olduğunu beş Plasmodium parazitler tarafından nedeniyle oluşur.

Şu anda, sıtma tanısı için mükemmel daha az tekniklerdir. Optik mikroskobu, geçerli altın standart, sadece 62-88 parazitler/µL kullanılan yöntem6bağlı olarak algılayabilir. Ayrıca, intensiveness ve yüksek beceri gerekli, birçok bölgeler mikroskopi misdiagnoses nedeniyle > özellikle düşük parasitaemia sahip olanlar doğrudan kaynakları alanında ve sonuçlarında eksikliği bağlanabilir2, seviyesi %50 Olguların anti-sıtma ilaçları suistimal. Hızlı tanı antikorlar algılama ve ayırımcılık ve parazitlerin DNA’ölçmek polimeraz zincir tepkimesi (PCR) deneyleri için kullanan testleri (RDTs), diğer 2 ana tanı yöntemleri vardır. Şu anda, RDTs sadece P. falciparum ve P. bağlı en az 100 parazit/µL kan hastalığı tedavi edilmezse nadir formlarda kaynaklanan tespit edebiliyoruz. 7 , 8 buna ek olarak, PCR deneyleri ayırımcılık ve Plasmodium farklı tür bir duyarlılık 0.0004-5, ölçmek parazitler/µL kan. Ancak, bu pahalı reaktifler, ekipman ve teknik beceri gerektirir ve böylece alan uygulama için uygun değildir.

Son derece hassas, güvenilir ve uygun fiyatlı bir teknik tanı kez, böylece hasta sonuçları iyileştirilmesi ve hastalık ortadan kaldırılması mümkün hale geliştirmek için önemlidir. Zayıflatılmış toplam yansıma Fourier dönüşümü (ATR-FTIR) spektroskopisi bu sorun için olası bir çözüm sunar. Önceki çalışma algılamak ve P. falciparum kan filmler algılama sınırları elde sabit metanol ölçmek mümkün olduğunu göstermiştir < 1 parazit/µL kan (< %0.0002 parasitemia) PCR yöntemleri için karşılaştırılabilir olan9,. Son yıllarda yapılan çalışmalarda algılamak ve parazitler sulu örneklerinde ölçmek ve böylece fiksasyon adım ortadan kaldırmak mümkün olduğunu göstermiştir. Ancak, su buharı, spektral gürültü ve veri tedavi gibi faktörler en iyi sonuçları10için dikkate alınması gerekir.

Yeni kullanıcılar ATR-FTIR spectra almak ve sulu kırmızı kan hücreleri (RBC) örnekleri10 P. falciparum tespiti için bir regresyon modeli hazırlamak nasıl göstermek için bu protokolü amaçlamaktadır.

Protocol

Lütfen uygun malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) başvurun ve uygun seviye 2 (BSL-2) eğitim aramak. Tüm kodlamayla adımları aseptik teknik kullanılarak, eğer zararlı UV ışınlarına maruz dekontaminasyon adımları, iğne sopa yaralanmalar ve biyolojik etkilenme olasılığını ortadan kaldırmak ve enfeksiyon riski olduğu anlamına gelir bir BSL-2 dolapta yapılmalıdır parazit kültür herhangi bir yaralanma girer. Ayrıca, stok kan kan bankalardan belirli hastalıklar ve kan hastalıkları kaynaklı …

Representative Results

Kısmi en küçük kareler (PLS-R) Arsa ve onun ilişkili regresyon vektör, Şekil 1a ve 1b sırasıyla, parazit sinyal bir doğrusal regresyon modeli için kullanılacak form için kullanılabilir RBCs yeterince farklı olduğunu göstermektedir tahmin parazitler ve gelecekteki veri kümesi. Sağlam, doğrusal PLS-R modeli 0,87 bir R-kare değeri ile oluşturulan ve %0.13 parasite…

Discussion

PLS-R modeli Doğrusal bir ilişki, Y bulduğu bir yöntemdir denetimli birden fazla varyasyon = bX + E on, akıllı değişken X arasındaki (burada, her wavenumber absorbans) ve sürekli değişken Y (burada, parasitemia düzey). Kısacası, model değişkenleri x korelasyon x ile Y farkı yakalamak gizli değişkenler (LVs) yeni bir dizi oluşturmak için birleştirir ve regresyon vektör (b) hesaplar bu y değeri tahmin yeni bir spektrum sonuçları ile çarpılır. İki değer modeli gücünü alınabilir: R2</…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar için finansman Avustralya Araştırma Konseyi tarafından sağlanan (gelecek bursu FT120100926 BRW için), Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi, Avustralya’da (Program grant ve kıdemli araştırma bursu için JGB; Erken kariyer bursu JSR; Altyapı araştırma enstitüleri destek düzeni Grant Burnet Enstitüsü için), ve Victoria Eyalet hükümeti operasyonel alt yapıyı desteklemek Burnet Enstitüsü için Grant. Bay Finlay Shanks enstrümantal desteği anıyoruz.

Materials

Donor blood Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood Australian Red Cross`
3D7 Plasmodium falciparum The Burnet Institute Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich R6504
Albumax (Gibco) Thermofisher E003000PJ Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Giemsa Stain Sigma Aldrich 48900
Sorbitol Sigma Aldrich S1876 Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers) Becton, Dickonson and Company 367671
Immersion Oil Thermofisher M3004
50 mL culture dishes Falcon 353025
25mL pipette tips Falcon 357515
10mL pipette tips Falcon 357530
Microscope Slides Sigma Aldrich S8902
Centrifuge tubes 50 mL Sigma Aldrich T2318
Automated pipette controller Integra-biosciences 155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermofisher 75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators Thermofisher 310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope Nikon Instruments E100_2CE-MRTK-1 When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment Bruker 9308-3700 Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab Mathworks Inc Multivariate data analysis software
The Unscrambler X CAMO Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox Mathworks, Inc. GUI for Matlab

Referencias

  1. Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
  2. World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
  3. Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
  4. White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
  5. Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
  6. Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
  7. Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
  8. World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
  9. Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
  10. Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
  11. Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
  12. Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
  13. Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
  14. Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
check_url/es/56797?article_type=t

Play Video

Citar este artículo
Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).

View Video