Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética

Resumen

Este protocolo describe la síntesis de partículas magnéticas y evaluación de sus propiedades de unión al ADN mediante dispersión de luz dinámica y electroforética. Este método se centra en monitorear los cambios en el tamaño de las partículas, su polidispersidad y potencial zeta de superficie de la partícula que juegan importante papel en el atascamiento de materiales como el ADN.

Resumen

Aislamiento de ADN utilizando partículas magnéticas es un campo de gran importancia en la investigación de biotecnología y biología molecular. Este protocolo describe la evaluación de las partículas magnéticas de DNA de enlace vía dispersión ligera dinámica (DLS) y dispersión de la luz electroforética (ELS). Análisis por DLS ofrece valiosa información sobre las propiedades fisicoquímicas de las partículas incluyendo tamaño de partícula, polidispersidad y potencial zeta. Este último describe la carga superficial de la partícula que juega papel importante en la Unión electrostática de materiales como el ADN. Aquí, un análisis comparativo explota tres modificaciones químicas de nanopartículas y micropartículas y sus efectos sobre la Unión de ADN y elución. Modificaciones químicas por ramificaron polietilenimina, Tetraetilo ortosilicato y (3-aminopropil) trietoxisilano son investigados. Puesto que el ADN exhibe una carga negativa, se espera que potencial zeta de superficie de la partícula disminuye al atascamiento de la DNA. Formación de clusters debe afectar también a tamaño de partícula. Para investigar la eficacia de estas partículas en el aislamiento y la elución de la DNA, las partículas se mezclan con el ADN en pH bajo (~ 6), la alta fuerza iónica y el ambiente de la deshidratación. Se lavan las partículas de imán y luego ADN es eluido por tampón Tris-HCl (pH = 8). Número de copias de ADN se estima usando la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (PCR). Tamaño de partícula, potencial zeta y datos cuantitativos de PCR, polidispersidad se evaluó y se comparó. DLS es una perspicaz y método de análisis que agrega una nueva perspectiva para el proceso de proyección de partículas de ADN de apoyo.

Introducción

Extracción de ADN es uno de los pasos más esenciales en biología molecular. El desarrollo de métodos de extracción de ácidos nucleicos tiene gran impacto en los campos emergentes de la genómica, la metagenómica, la epigenética y la transcriptómica. Hay una amplia gama de aplicaciones biotecnológicas para el aislamiento de la DNA incluyendo médicos (herramientas forenses y diagnóstico y pronóstico) y aplicaciones medioambientales (diversidad biológica de la metagenómica, prevalencia del patógeno y vigilancia). Ha habido una creciente demanda para purificar y aislar ADN de diversos materiales y en diferentes escalas como sangre, orina, tierra, madera y otros tipos de mu....

Protocolo

1. síntesis de nanopartículas magnéticas

1. síntesis de nanopartículas magnéticas estabilizan con citrato (MNPs)
   1. Añadir 20 mmol de FECLAS ₃ ∙ 6 H ₂ O (5,406 g) y 10 mmol de FECLAS ₂ ∙ 4 H ₂ O (1,988 g) en 20 mL de agua bidestilada desoxigenada (agua de ddd). Revuelva obtenida la solución vigorosamente en vaso bajo atmósfera de N ₂ con un agitador mecánico hasta obtener una solución transparente.
   2. Bajo agitación mecánica rápida, añadir 150 mL de 1 M NH ₄ OH, gota a gota con embudo (tomar 1 h o más si es necesario). Transferir la solución en un vaso s....

Resultados

Utilizando el protocolo descrito aquí para síntesis química y la modificación de las partículas magnéticas, seis partículas magnéticas se sintetiza y se analizaron para el atascamiento de la DNA. Un resumen del análisis se muestra en la tabla 1. Comparando el tamaño de las partículas en el agua y en la solución de Unión, es claro que todas las partículas de agregaron en enlace solución por pliegues 2-22. Algunas partículas más agregan a más pliegues en la presencia de ADN.......

Discusión

En el presente Protocolo, los principios teóricos que explican la Unión de ADN a las partículas magnéticas vía potencial zeta estaban bajo pregunta. El protocolo describe la síntesis y modificación de nanopartículas magnéticas y micropartículas. También se describen el método para la preparación de la solución de control y enlace de ADN. Aquí se muestran dos estrategias para la detección de interacciones de partículas de ADN: PCR cuantitativa y DLS se acerca. DLS ofrece tres indicadores de cambios fisicoquímicos en las p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro de hierro (III) hexahidratado	Sigma-Aldrich	207926	Síntesis de partículas magnéticas
Cloruro de hierro (II) tetrahidratado	Sigma-Aldrich	380024	Síntesis de partículas magnéticas
Sulfato de hierro (II) heptahidratado	Sigma-Aldrich	F8263	Síntesis de partículas magnéticas
Acetona	Penta	10060-11000 Síntesis de	partículas magnéticas
Citrato de sodio dihidratado	Sigma-Aldrich	W302600	Síntesis de partículas magnéticas
Ortosilicato de tetraetilo	Sigma-Aldrich 131903		Síntesis de partículas magnéticas
(3-aminopropil)trietoxisilano	Sigma-Aldrich	440140	Síntesis de partículas magnéticas
Polietilenimina, ramificada, promedio Mw ~25,000	Sigma-Aldrich	408727	Síntesis de partículas magnéticas
Solución de hidróxido de amonio	Sigma-Aldrich	221228-M	Síntesis de partículas magnéticas
Etanol	Penta	71250-11000	Síntesis de partículas magnéticas
Nitrato	de potasio Sigma-Aldrich	P6083	Síntesis de partículas magnéticas
Hidróxido de potasio	Sigma-Aldrich	1.05012	Síntesis de partículas magnéticas
membrana de corte de peso molecular (Mw = 1 kDa)	Laboratorios de espectro	G235063	Síntesis
de partículas magnéticasAgitador de techo	con Labortechnik GmbH	DH. WOS01035	Síntesis de partículas magnéticas
Baño de agua	Memmert GmbH + Co.	84198998	Síntesis de partículas magnéticas
Sonicator	Bandelin	795	Síntesis de partículas magnéticas
MARCA Cubeta UV micro	Sigma-Aldrich	BR759200-100EA	Cubeta para medición de tamaño
Tapón de MARCA para cubeta UV micro	Sigma-Aldrich	BR759240-100EA	Tapones de cubeta para medición de tamaño
Capilar Plegado Zeta Cell Malvern		DTS1070	Cubeta para la medición del potencial zeta
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	Dispositivo para la medición del tamaño y el potencial zeta
Infinite 200 PRO NanoQuant instrumento	Tecan	396 227 V1.0, 04-2010	dispositivo para la medición de la concentración de ADN
SYBR Green Kit RT-PCR Cuantitativo	Sigma-Aldrich	QR0100	Kit de PCR
Mastercycler pro S instrumento	Eppendorf	6325 000.013	Termociclador
Kit MinElute	Qiagen	28004	Kit de purificación de ADN
Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	S7670	Unión de ADN