El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) sistema proporciona una herramienta prometedora para la ingeniería genética y abre la posibilidad de integración dirigida de los transgenes. Describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-estrategia por turnos para ADN eficiente objetivo integración en vivo y dirigida terapias genéticas usando CRISPR/Cas9.
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Artículo de método
Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología
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Resumen
Resumen
Como una plataforma de edición de genoma prometedora, el sistema CRISPR/Cas9 tiene gran potencial para la manipulación genética eficiente, especialmente para la integración dirigida de los transgenes. Sin embargo, debido a la baja eficiencia de recombinación homóloga (HR) y las varias mutaciones indel de no homóloga se terminan uniendo (NHEJ)-basado en estrategias en las células no se dividen, en vivo genoma edición sigue siendo un gran desafío. Aquí, describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-sistema CRISPR/Cas9 eficiente en vivo precisa integración específica. En este sistema, el genoma de destino y el donante vector que contiene los brazos de homología (~ 800 bp) flanqueado por destino de RNA (sgRNA) solo guía secuencias son troceadas por CRISPR/Cas9. Esta estrategia basada en HMEJ logra integración eficiente del transgen en cigotos de ratón, así como en hepatocitos en vivo. Por otra parte, una estrategia basada en HMEJ ofrece un enfoque eficaz para la corrección del fumarylacetoacetate hidrolasa (Fah) mutación en los hepatocitos y rescata Fah-deficiencia inducida por ratones de insuficiencia hepática. Tomados en conjunto, centrándose en el objetivo integración, esta estrategia basada en la HMEJ proporciona una herramienta prometedora para una variedad de aplicaciones, incluyendo la generación de modelos animales modificados genéticamente y terapias genéticas específicas.
Introducción
La edición del genoma, precisa, específica es a menudo necesaria para la producción de modelos animales modificados genéticamente y tratamientos clínicos. Se ha realizado mucho esfuerzo para desarrollar diversas estrategias para el genoma objetivo eficiente de edición, como nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras como activador de transcripción (TALENs) y sistemas de CRISPR/Cas9. Estas estrategias crean roturas de doble cadena DNA específicas (OSD) en el genoma y toman ventaja de intrínsecos sistemas de reparación del ADN, como la recombinación homóloga (HR)1,2, microhomology-mediada se terminan ....
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Protocolo
Todos los procedimientos incluyendo temas animales han sido aprobados por el Comité de ética de investigación biomédica en los institutos de Shangai para la ciencia biológica (CAS).
1. diseño de donante plásmidos
-
Selección de sgRNA
- Utilizar herramientas de diseño en línea CRISPR para predecir sgRNAs en la región de destino de12,11,13,14,15. Para el locus Cdx2 , diseño seis sgRNAs diferentes (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6....
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Resultados
Edición del genoma basado en HMEJ en embriones de ratón: Para definir la eficiencia knock-in del método basado en la HMEJ de cigotos de ratón, entregamos Cas9 mRNA, sgRNA contra el gen Cdx2 y el donante HMEJ en cigotos de ratón, que fue diseñado para fundir un gen reportero de p2A-mCherry al codón de último de la Cdx2 gen (figura 2A). Los cigotos inyectados convirtieron en blastocistos en la cultura. Para ev.......
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Discusión
Los pasos más críticos en la construcción de plásmidos de donantes HMEJ son: (1) selección de lo sgRNA con alta eficiencia de clivaje de ADN y baja distancia entre sgRNA corte y codón de parada y construcción (2) adecuada de donantes HMEJ. Escote CRISPR/Cas9-mediada en tanto vector de donante transgénico (contiene ~ 800 bp homología brazos y sitios de destino sgRNA) y genoma específica es necesario para la integración específica eficiente y precisa en vivo. Los pasos más críticos de generación de golpe en ratone.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por CAS estratégicas prioritarias programa de investigación (XDB02050007, XDA01010409), el nacional Hightech R & D programa (programa 863; 2015AA020307), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (NSFC concede 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), programa de talentos China juvenil de mil (en HY), rotura a través del proyecto de la Academia China de Ciencias, Shanghai ciudad Comité de ciencia y tecnología proyecto (16JC1420202 a HY), el Ministerio de ciencia y tecnología de China (más; 2016YFA0100500).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| vector pAAV | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | Vector AAV para codificar un SpCas9 optimizado para codón humano impulsado por el promotor de EFs |
| AAV_Actb HMEJ | donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA Addgene | 97308 | Donante de HMEJ para fusionar un reportero de p2A-mCherry con Actb de ratón. EGFP impulsado por el promotor de EF1a y sgRNAs impulsados por U6 dirigidos a Actb. Red troncal AAV. |
| AAV_Cdx2 Donante de HMEJ | Addgene | 97319 | Donante de HMEJ para fusionar un reportero de p2A-mCherry con Cdx2 de ratón. |
| Lipofectamina 3000 Reactivo de transfección | Tecnología de vida | L3000015 | |
| Agua libre de nucleasa | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonucleasa I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Ensamblaje Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plásmido EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Extractor de micropipetas | Sutter Instrument | P-97 | Extractor de micropipetas (parámetros: calor, 74; tracción, 60; velocidad, 80; tiempo/retardo, 200; presión, 300) |
| Vidrio de borosilicato | Sutter Instrument | B100-78-10 | tipo de capilares (diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,78 mm con filamento) |
| Microinyector FemtoJet | Eppendorf | ||
| Microtomo de congelación | Leica | CM1950-Espesor del criostato | de 40 μ m para cerebro, 10 μ m para hígado |
| Conejo anti-mCereza | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniCabra pura Anti-Conejo IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| Pluma,Estreptococo,Glutamina | Gibco | 10378016 | |
| Kit de extracción de gel | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Citocalasina B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA con D-Glucosa y Fenol | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medio con Fenol | Rojo Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Aceite mineral | Sigma |
Referencias
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells usin....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy
Posted by JoVE Editors on 3/10/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay" to " T7 endonuclease I" respectively.
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
- Surveyor nuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
to:
- T7 endonuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
