Vivo에서 Murine 좌 골 신경의 모델 Perineural 내 습

Summary

좌 골 신경으로 syngeneic 췌장암 세포를 주입 하 여는 vivo에서 murine 모델 perineural 내 습의 설명 합니다. 모델 신경 내 습의 넓이의 부 량과 perineural 내 습의 세포 및 분자 메커니즘의 조사를 지원 합니다.

Abstract

암 세포 나 perineural 내 습 (PNI)는 암에서 세포 증식 및 신경 microenvironment에서 마이그레이션 프로세스를 통해 신경 침공. 이 침공의 다양 한 암 종류에 의해 전시 유형과 매우 자주 췌장암에서 발견 된다. 마우스 췌 장 내 신경 섬유의 미세한 크기 orthotopic murine 모델에 어려운 PNI의 연구를 렌더링합니다. 여기, 우리가 PNI, 어디 우리가 주입 syngeneic 췌장암 세포 라인 Panc02 H7 murine 좌 골 신경의 모델 heterotopic vivo에서 설명 합니다. 이 모델에서 좌 골 신경 마 취 쥐의 노출 하 고 암 세포를 주입. 암 세포 주입의 지점에서 척수를 향해 proximally 신경에 침입 한다. 침공된 좌 골 신경 다음 추출 하 고 10 월 냉동 단면에 대 한 처리. H & E와이 섹션의 면역 형광 염색 단백질 표정에 침입과 변경의 두 학위의 정량화를 허용 합니다. PNI 주어진 그 다양성에 대 한 연구의 다양 한에이 모델을 적용할 수 있습니다. 다른 유전 수정 또는 다른 종류의 암 세포를 마우스를 사용 하 여 다른 암 종류 및 PNI의 세포 및 분자 메커니즘의 조사에 대 한 수 있습니다. 또한, 신경 침공에 대 한 치료제의 효과이 쥐를 치료를 적용 하 여 공부 될 수 있다.

Introduction

신경 자극 암 성장 및 마이그레이션^1,2,3특정 종양 microenvironment를 형성 한다. Perineural 내 습 (PNI)는 암 통해 세포 및 신경 주위에 침략 하는 과정입니다. 그것은 신경 따라 원본 사이트에서 확장 암 침공 이후 전이의 유일한 노선으로 고려할 수 있습니다. PNI는 발생률이 22%에서 100^1,2에 이르기까지 췌 장, 전립선, 머리 및 목, 침, 자 궁, 대 장 암 등 여러 암 종류에서 발견 된다. PNI 통증 연관 이며 더 생존 요금^1,2, 빈약한 예 지와 연관 시킵니다.

Perineural 내 습의 모델 개발이 과정의 세포 및 분자 메커니즘을 명료 하 고 후보 치료제 PNI를 감소 테스트에 필수적 이다. 암과 신경 사이 상호 작용을 공부 방법은 시험관에 암 세포 신경 explants⁴, 느 루트 절^5,6,7, 또는 특정 셀의 공동 문화를 포함 신경에서 microenvironment 같은 Schwann 세포⁷. 그러나 Vivo에서 접근,, 더 순수 관련, 암 마우스 모델에서 암 유발 되거나 이식의 사용을 포함 되며 전체 신경 microenvironment에 대 한 회계의 이점이 있다. Orthotopic에서 췌 장 또는 전립선 암, PNI 모델 보고^8,,910 고 PNI의 발생률, 기록 될 수 있습니다 되었지만 그 기관에서 신경의 작은 크기 때문에 그것은 어려운 볼 수 전체 신경 따라서 PNI의 정도 계량 하기. 우리는 여기에 설명 하는 모델 PNI는 암 세포는¹¹간단한 수술 통해 쥐의 좌 골 신경에 주입의 비보에 모델이입니다. Heterotopic 이식으로 척수 신경 내의 침공. 척수 주사의 사이트에서 신경 침공의 길이 신경 내 암의 볼륨 뿐만 아니라, 측정 될 수 있습니다. 중요 한 것은, 침략된 신경 분석 현미경, 분자 분석을 포함 한 다양 한도 수집할 수 있습니다. 암 세포의 다양 한 시험 될 수 있다, 그리고 호스트 쥐 유전자 수정 되거나 특정 화합물으로 치료도 사용 될 수 있습니다. 이 강력한 분석 결과 암 세포 및 호스트 microenvironment PNI의 메커니즘에 조사에 대 한 수정할 수 있습니다.

Protocol

동물 주제와 절차의 모든 기관 동물 관리 및 사용 위원회 기념 슬로 안 Kettering 암 센터에 의해 승인 되었다. 1입니다. 암 세포의 준비 37 ° c.에 5 분 동안 0.25 %trypsin 수확 하위 confluent Panc02 h 7 셀 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포를 수집 합니다.참고: 셀에서에서 재배 되 고 T-225 플라스 크, 포함 약 12 x 10 80 %confluency 및 4 mL trypsin에 플라스 크 당6 셀/플라스 크를 사?…

Representative Results

이 방법은 같지는 신경의 비보에 모델을 만드는 murine 좌 골 신경으로 췌장암 세포의 외과 이식을 설명 합니다. 그림 1 좌 골 신경의 해 부 위치 및 주사의 사이트를 보여 줍니다. 그림 2 는 누드 마우스의 두 좌 골 신경. 주입 하는 PBS 신경 (왼쪽) MiaPaCa-2 암 세포 (오른쪽)와 함께 주입 하는 신경에 비교 될 수 있습니다. 암 ?…

Discussion

이 프로토콜에서 우리는 vivo에서 murine 모델 췌장암 세포에 의해 좌 골 신경의 정량화에 대 한 있도록 perineural 내 습의 기술. 이 모델에는 신경의 분자 메커니즘의 연구 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여 성공적인 실험 과정에서 3 개의 중요 한 단계에 대 한 신중 접근 필요: 1)의 주입 암 세포 (2.7, 2.8), 단계 2) 침공된 신경 (3.4 단계)의 추출 및 수확된 신경 (4.1 단계)의 3) 처리.

<p class="jove_con…

Materials

Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1