Directe neuronale herprogrammering genereert neuronen die de leeftijd van de begincel van somatische handhaven. Hier beschrijven we een enkele vector-gebaseerde methode voor het genereren van geïnduceerde neuronen van dermale fibroblasten van volwassen menselijke donors verlangde.
Geïnduceerde neuronen (iNs), het product van somatische cellen direct omgezet in neuronen, zijn een manier om de patiënt afkomstige neuronen te verkrijgen van weefsel dat is gemakkelijk te bereiken. Via deze route, kunnen volwassen neuronen worden verkregen in een kwestie van een paar weken. Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle one-step-protocol om iNs verkrijgen dermale fibroblasten verkregen via biopsie monsters van volwassen menselijke donoren. We leggen elke stap van het proces, met inbegrip van het onderhoud van de dermale fibroblasten, de bevriezing procedure om te bouwen van een voorraad van de cellijn, zaaien van de cellen voor herprogrammering, evenals de kweekomstandigheden tijdens het conversieproces. Daarnaast beschrijven we de voorbereiding van glas coverslips elektrofysiologische opnamen, op lange termijn coating voorwaarden en fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS). We illustreren ook voorbeelden van de resultaten te verwachten. Het protocol hier beschreven is gemakkelijk uit te voeren en kunnen worden toegepast op menselijke fibroblasten afgeleid van menselijke huid Biopten van patiënten met verschillende leeftijden en verschillende diagnoses. Dit protocol genereert een voldoende hoeveelheid iNs die kan worden gebruikt voor een breed scala van biomedische toepassingen, waaronder ziekte modellering, drug screening, en target validatie.
Ontwikkeling van doeltreffende behandelingen voor neurologische stoornissen hebben belemmerd door de beperkte toegang tot levende cellen van het menselijk brein mechanistisch onderzoek en functionele tests uit te voeren. Ongeveer een decennium geleden, deze situatie radicaal veranderd met de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSCs) technologie1,2. Dit, gecombineerd met een beter inzicht in de mechanismen van de neurale differentiatie die zich voordoen tijdens normale menselijke ontwikkeling, heeft toegestaan voor de generatie van gedefinieerde en diverse neuronale subtypen van patiënt en ziekte specifieke materiaal. Met dergelijk materiaal is het nu mogelijk om te studeren van intracellulaire mechanismen ten grondslag liggen aan neurologische ziekten en het potentieel van de verschillende verbindingen te verlichten die pathologische kenmerken3.
Terwijl iPSCs revolutionair op het gebied van de neurowetenschappen zijn, is één groot nadeel van deze cellen dat hun handtekening vergrijzing is gewist tijdens het herprogrammering op zodanige wijze dat de verjongd neuron het beveiligingslek is gekoppeld niet behouden veroudering4,5,6. Deze bijzondere functie van de neuronen die worden geproduceerd kan uiteindelijk essentieel voor Recapitulerend vele aspecten van de intracellulaire pathogene cascade, met name in het geval van ziekten waarvoor ouderdom een belangrijke risicofactor is.
Directe neurale herprogrammering is een techniek waar een aantal somatische cellen wordt direct omgezet in een tussentijdse fase zonder tussenkomst van een pluripotente iN. Dit zorgt voor snelle menselijke neuronen in vitro dat zowel de patiënt als de ziekte specifieke kunnen generatie. Een opmerkelijk kenmerk van directe herprogrammering is dat de eerste leeftijd van de donor-cel wordt gehandhaafd, en daarmee de kwetsbaarheid voor vergrijzing processen zoals productie van oxidatieve stress4,7 verhoogde. Dientengevolge, iNs van patiënten met neurologische aandoeningen in verband met de vergrijzing, zoals Alzheimer en Parkinson, zijn geschikt voor een brede waaier van biomedische toepassingen met inbegrip van ziekte modellering, drug screening tests, en toxicologische studies .
Het belangrijkste voorbehoud dat heeft verhinderd iNs patiënten met neurodegeneratieve aandoeningen wordt wijd gebruikt is dat ze niet gemakkelijk zijn te herprogrammeren, en dit nog moeilijker met uitbreiding van de fibroblasten wordt. Generatie iN cellen in de hoeveelheden die nodig zijn voor dit soort toepassingen is daardoor niet tot pas onlangs8bereikt. We hebben nu een eenvoudige methode om te herprogrammeren fibroblasten van donoren van elke leeftijd in een zeer efficiënte wijze ontwikkeld. Deze methode combineert de gedwongen uitdrukking van de neuronale transcriptiefactoren, Ascl1 es Brn2 met een knockdown van de onderdrukker eiwit RE1-tot zwijgen brengen transcriptiefactor (rust) met behulp van een enkele vector. Hier beschrijven we de verschillende stappen die leiden naar de generatie van iNs uit de huid fibroblasten biopsied van ouderen donoren worden omgezet.
Deze one-One-Step/één vector herprogrammering methode biedt een efficiënte manier voor het verkrijgen van iNs uit menselijke volwassen fibroblasten. Menselijke volwassen fibroblasten zijn normaal gesproken veel moeilijker aan dekking dan foetale fibroblasten, met beperkte studies eerder efficiëntie van ongeveer 5-10%12,13te rapporteren. Met dit nieuwe protocol is het echter mogelijk om een neuronale rendement (gemeten als MAP2 + cellen) van ongeveer 50%8. Bovendien, kan onze protocol worden gebruikt op dermale fibroblasten, die hebben al meerdere keren gepasseerd zonder verlies van efficiëntie van conversie. Tot nu toe hebben we gepasseerd tot 14 keer zonder opsporing van een afname van de omzettingsefficiëntie cellen gebruikt. Ook, is er geen verschil in de herprogrammering van efficiëntie in onze handen met fibroblasten van donoren van leeftijd tussen 52 en 87. Zie verwijzing8voor meer details over de leeftijd en de ziekte van andere cellijnen getest met deze constructie. Andere studies hebben ook geen verschil in conversie-efficiëntie met behulp van een lentivirale gebaseerde en kleine molecuul-enhanced protocol met donoren tussen 0 en 89 jaar4gemeld. Bovendien is consistent toepasbaarheid met miRNA gebaseerde neuronale herprogrammering gemeld in fibroblasten van alle leeftijden, met donoren tussen 0 en 86 jaar7. Via deze route, kunnen volwassen neuronen worden verkregen in ongeveer 12 tot 15 weken in vitro of ongeveer 8 weken na transplantatie in vivo8. Dit is voordelig omdat het geeft toegang tot zowel de ziekte en de patiënt specifieke menselijke iNs uit weefsel dat is gemakkelijk te bereiken. Hoewel dit protocol efficiënt is, het zal niet produceren een neuronale rendement van 100%, en als zodanig een zuivering via FACS bijvoorbeeld is vereist.
De meest kritische stap in dit protocol is virale transductie (protocol punt 4). Het is cruciaal dat de titer van het virus precies naast hebben vergulde een nauwkeurige aantal aHDFs voor conversie. De aanbevolen titer voor gebruik met dit protocol is tussen de 4 x 10,8 en 4 x 109. Met behulp van een titer van iets minder dan 1 x 108 zou niet worden aanbevolen als het toevoegen van grote hoeveelheden virus zal worden giftig voor de cellen. Bovendien, als de fibroblasten te converteren naar iNs beginnen zullen ze meer kwetsbaar en gevoelig voor opheffing. Het is essentieel om te zacht bij het wijzigen van de media niet te storen van de cellen te veel. Dit kan gebeuren door het verwijderen van de vloeistof langzaam met een 1.000 µL pipet. Tot slot, wanneer plating voor herprogrammering (protocol sectie 3) is het belangrijk om een gezonde fibroblast bevolking voordat u begint met een experiment; Dit wordt aangegeven door een levensvatbaarheid van de cellen van boven de 90% met trypan blauw kleuring. De aHDFs moet altijd vóór het bereiken van 95% confluentie worden gepasseerd.
Als er merkbaar celdood voordat virale signaaltransductie, conversie niet beginnen: dubbel te controleren dat de levensvatbaarheid van de cellen boven de 90 is % en dat er geen problemen met de coating van de plaat waren. Verwacht wordt dat het hebben van een kleine hoeveelheid virale transductie na de dood van de cel, maar dit mag geen significante. In dit geval bevestig nauwkeurig zaaien van 50.000 aHDFs/put en controleren van de titer van het virus. Als er merkbaar inconsistentie tussen putten tijdens de conversie, controleer dan eerst dat elke put een gelijke hoeveelheid van media bevat en openlijke verdamping is niet die zich aan de randen (indien nodig extra media kunnen worden toegevoegd aan de putten rand). Als alternatief, Controleer stap 4.4 en zorgen voor passende mengen tot een homogene opschorting als transducing. Het is van cruciaal belang de lentivirus eerst, aan het medium toevoegen voordat het toevoegen van deze in de putjes. Direct toevoegen lentivirus in de putjes goed tot goed variabiliteit zal toenemen en is ook waarschijnlijk giftig voor de cellen. Ten slotte, Controleer altijd dat het medium wordt opgewarmd tot 37 ° C alvorens toe te voegen aan de cellen.
Dit protocol bevat optionele secties voorwaarden coating voor lange termijn cultuur van iNs en FACS sorteren te verhogen van neuronale zuiverheid. Voor experimenten willen onderzoeken van functionele karakterisering van iNs, is een protocol voor bereiding van glas coverslips voor electrofysiologie ook opgenomen. Het protocol van conversie hier is ingesteld voor gebruik met een 24-well plaat; Indien gewenst kan dit worden gewijzigd tot een 6 – 12-, 48-, 96-wells-plaat of kolven. Wijzig in dit geval alle volumes op het oppervlak van de plaat of kolf gebruikt.
Dit protocol maakt gebruik van de gedwongen uitdrukking van Ascl1 es Brn2 in combinatie met een REST knockdown alle verpakt in één enkele vector8 voor het genereren van iNs van een pan-neuronale fenotype. De generatie van alle gliale subtypen met deze methode echter is niet beoordeeld. Deze methode zou dus moeten worden aangepast voor gebruik met andere herprogrammering factoren te verkrijgen subtype specifieke neuronen. Directe herprogrammering, heeft de mogelijkheid voor het genereren van motorische neuronen, sensorische neuronen, researchdieren, striatale middellange Maxomys neuronen en Dopaminerge neuronen10,14, eerder getoond. Dit zal gunstig zijn bij het onderzoeken van neurologische ziekten in welke specifieke neuronale subtype netcongestieproblemen ondervinden, voor voorbeeld van Parkinson en Dopaminerge neuronen.
Tot voor kort deed direct neurale herprogrammering technologie niet toestaan voor de productie van iNs op een gestandaardiseerde en efficiënte wijze — tot een niveau dat is vereist voor Toxicologie en drug screening tests op grote schaal. Deze nieuwe methode is zeer efficiënt en kan worden gebruikt op de fibroblasten die hebben al gepasseerd vele malen, zodat het nu deze beperkingen verwijdert en voor een breed scala van studies, ontsluit niet alleen in een menselijke zenuwstelsel, maar ook in een systeem dat kan worden patiënt specifieke. De eenvoud van deze aanpak maakt het iN technologie toegankelijk voor groepen die willen uitvoeren van soortgelijke studies in-house en kan gemakkelijk worden gebruikt niet alleen voor grote schaal biomedische applicaties, zoals drug screening en toxicologie vitrotests, maar ook ter ondersteuning van gegevens afgeleid van diermodellen en menselijke post-mortem weefselmonsters.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Marie Persson Vejgården voor technische bijstand. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van de New York stamcel Foundation, de Europese Onderzoeksraad onder het zevendekaderprogramma van de Europese Unie: FP/2007-2013 Neuro stamcel reparatie (nr. 602278) en EOR-Subsidieovereenkomst geen. 30971, de Zweedse Onderzoeksraad (subsidieovereenkomst 521-2012-5624, 2016-00873 en 70862601 / Bagadilico), Zweedse Parkinson Foundation (Parkinsonfonden) en de strategische onderzoeksruimte op Lund Universiteit Multipark (multidisciplinair onderzoek in Ziekte van Parkinson). Janelle Drouin-Ouellet wordt ondersteund door een fellowship van de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) (#358492), en Roger Barker wordt ondersteund door een toekenning van de NIHR Biomedical Research Centre aan de Universiteit van Cambridge/Addenbrooke van ziekenhuis. Malin Parmar is een New York stamcel Stichting Robertson-Detective. Shelby Shrigley wordt gefinancierd door de Europese Unie Horizon 2020-programma (H2020-MSCA-ITN-2015) onder de Marie Skłodowska-Curie opleidingsnetwerk innovatieve en Grant overeenkomst nr. 676408.
Cell Lines | |||
Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old male. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
Milli-Q Water | Millipore | ||
Basal medium – Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
Neural differentiation medium – NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
Reagents for Coatings | |||
Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
Cell dissociation agent – Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, – phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
Reagents for Glass Coverslips | |||
Autoclaved deionized water | |||
Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
Ethanol 95% | |||
Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
Reagents for Immunocytochemistry | |||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
Equipment | |||
T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 – 1,000 µL. | ||
Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
Parafilm M | VWR | ||
ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
Laminar flow hood | |||
Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
Orbital shaker | |||
Sonicator – Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |