Complejidad de los sistemas en vivo hace que sea difícil distinguir entre la activación y la inhibición del receptor Notch por trans- y cis-ligandos, respectivamente. Aquí, presentamos un protocolo basado en los análisis agregación celular en vitro para la evaluación cualitativa y semicuantitativa de la Unión de la muesca de la Drosophila a trans-ligandos vs cis-ligandos.
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Artículo de método
Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos
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Resumen
Resumen
Señalización de Notch es un sistema de comunicación célula-célula evolutivamente conservado utilizado ampliamente en el desarrollo de animales y mantenimiento del adulto. Interacción del receptor Notch con ligandos de los vecinos células induce la activación de la vía de señalización (trans-activación), mientras que la interacción con ligandos de la misma célula inhibe la señalización (cis-inhibición). Equilibrio adecuado entre trans-activación y cis-inhibición ayuda a establecer niveles óptimos de señalización Notch en algunos contextos durante el desarrollo animal. Debido a los dominios de expresión superpuestos de la muesca y sus ligandos en muchos tipos celulares y la existencia de mecanismos de retroalimentación, estudiando los efectos de una determinada modificación poste-de translación en trans- y cis-interacciones de la muesca y sus ligandos en vivo es difícil. Aquí, describimos un protocolo para el uso de las células S2 de Drosophila en los ensayos de agregación celular para evaluar los efectos de derribar un modificador de la vía de Notch en la Unión de muesca a cada ligando trans y el cis. S2 las células transfectadas estable o transitorio con un vector de expresión de muesca se mezclan con las células que expresan cada ligando de Notch (serrado S2 o S2-Delta). Trans-unión entre los receptores y ligandos resulta en la formación de agregados celulares heterotípicos y se mide en términos del número de agregados por mL compuesto de > 6 células. Para examinar el efecto inhibitorio de cis-ligandos, S2 las células Co muesca y cada ligando se mezclan con las células Delta del S2 o S2-serrado y se cuantificó el número de agregados como se describió anteriormente. La disminución relativa del número de agregados debido a la presencia de cis-ligandos proporciona una medida de cis-ligand-mediada por la inhibición de la trans-vinculante. Estos ensayos sencillos pueden proporcionar datos semi cuantitativos sobre los efectos de manipulaciones genéticas o farmacológicas en la Unión de ranura a sus ligandos y pueden ayudar a descifrar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos en vivo de tales manipulaciones sobre la señalización de Notch.
Introducción
Canónica de la señalización de Notch es un mecanismo de comunicación de célula a célula de corto alcance que requiere contacto físico de los vecinos a las células para facilitar la interacción entre receptores Notch y sus ligandos1. Interacción del receptor Notch (presente en la superficie de las células receptores de señal) con ligandos (presentes en la superficie de envío de señal de las células) inicia la señalización de Notch y se conoce como trans-activación2. Por otro lado, la interacción entre muesca y sus ligandos en la célula misma conduce a la inhibición de la vía de Notch y es conocido como cis
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Protocolo
1. preparación de doble trenzado RNA (dsRNA) por caída de Shams
- Amplificación por PCR de los productos
- Utilice tipo salvaje blanco amarillo (w y) la DNA genomic y pAc5.1-EGFP como plantilla y las siguientes combinaciones de primer para amplificar los fragmentos de ADN utilizados en síntesis de dsRNA. Utilice el siguiente perfil térmico de PCR: desnaturalización (95 ° C, 30 s), recocido (58 ° C, 30 s) y extensión (72 º C, 1 min).
Mejorada de la proteína verde fluorescente Cartillas de dsRNA (EGFP) (5' - 3')-
Primer avance-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG<....
- Utilice tipo salvaje blanco amarillo (w y) la DNA genomic y pAc5.1-EGFP como plantilla y las siguientes combinaciones de primer para amplificar los fragmentos de ADN utilizados en síntesis de dsRNA. Utilice el siguiente perfil térmico de PCR: desnaturalización (95 ° C, 30 s), recocido (58 ° C, 30 s) y extensión (72 º C, 1 min).
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Resultados
Nuestras observaciones en vivo sugirieron que pérdida de la xylosyltransferase gene shams en el aumento de la señalización de Notch debido a aumentado mediada por Delta trans-activación de Notch sin afectar a la cis-inhibición de la Muesca por ligandos8. Para probar esta idea, fueron realizados en vitro estudios de agregación de células. En primer lugar, expresión de shams en células S2 fue derribado con sha.......
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Discusión
Canónica de la señalización de Notch depende de las interacciones entre el receptor Notch y sus ligandos5. Aunque la mayoría de los estudios sobre la vía de Notch considera principalmente la Unión de ranura y ligandos de células vecinas (trans), muesca y misma célula ligandos interactúan y estos llamados cis-interacciones pueden desempeñar un papel inhibitorio en la muesca señalización de3,4. Por consiguiente, para descif.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflicto de interés.
Agradecimientos
Los autores reconocen apoyo de NIH/NIGMS (R01GM084135 a HJN) y Fundación Mizutani Glycoscience (grant #110071 a HJN) y están agradecido a Tom V. Lee por discusiones y sugerencias sobre los ensayos y Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine y el Drosophila genómica recursos centro (DGRC) para líneas celulares y plásmidos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BioWhittaker Schneider' s Drosophila medium, Lonza modificada | 04-351Q | ||
| HyClone Penicilina-Estreptomicina 100X solución | GE Healthcare lifescience | ||
| CELLSTAR Placa de 6 pocillos | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR Placa de 24 pocillos | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Mini agitador VWR | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocitómetro | Fisher Sceintific | 267110 | |
| Reactivo de transfección FuGENE HD | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Kit de transcripción | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (Kit de purificación de ARN) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Microscopio invertido | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Cámara digital + software avanzado | AmScope | MU-900 Adquisición de | imágenes con el software ToupView |
| Kit de extracción rápida de gel PureLink | Invitrogen | ||
| GenDepot | F0600-050 | ||
| Metotrexato | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Higromicina B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Sulfato de cobre | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| Células S2 | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom células | Regalo de R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| Células S2-Delta | DGRC | 152 | |
| Células S2-Notch | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Regalo de S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate | Regalo de Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| Vector pMT-Notch | DGRC | 1022 | Regalo de S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Regalo de Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Biosistema aplicado | 1611091 | |
| Ensayo de expresión génica TaqMan para CG9996 (Shams) | Biosistema Aplicado | Dm02144576_g1 | con tinte FAM-MGB |
| Ensayo de expresión génica TaqMan para CG7939 (RpL32) | Dm02151827_g1 de Biosystem aplicado | con colorante FAM-MGB | |
| Sistema de PCR rápido en tiempo real Applied Biosystems 7900HT | Módulo | de bloque de 96 pocillos | 4351405 |
Referencias
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E.
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Reimpresiones y permisos
