Este método describe el clonaje, expresión y purificación de Nsa1 recombinantes para la determinación estructural por cristalografía de rayos x y dispersión de rayos-x de ángulo pequeño (SAXS) y es aplicable para el análisis estructural híbrido de otras proteínas que contiene tanto había ordenado y desordenado dominios.
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Artículo de método
La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae
En este artículo
Resumen
Resumen
Determinación de la estructura integral del factor de ensamblaje del ribosoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es un reto debido a la desordenada y proteasa lábil c-término de la proteína. Este manuscrito describe los métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análisis estructural por cristalografía de rayos x y SAXS. Cristalografía de rayos x fue utilizado para resolver la estructura del dominio N-terminal WD40 ordenado de Nsa1, y luego SAXS se utilizó para resolver la estructura de la terminal C de Nsa1 en solución. Se recopilaron datos de dispersión de solución de larga duración Nsa1 en solución. Las amplitudes de la dispersión teórica se calcularon a partir de la estructura cristalina de alta resolución de dominio WD40, y luego una combinación de cuerpos rígidos y modelado ab initio reveló el c-término de Nsa1. A través de este enfoque híbrido fue reconstruida la estructura cuaternaria de la proteína entera. Los métodos presentados aquí deben ser generalmente aplicables para la determinación estructural híbrido de otras proteínas compuesto por una mezcla de dominios estructurados y no estructurados.
Introducción
Los ribosomas son máquinas grandes ribonucleoproteína que llevan a cabo el papel esencial de la traducción de mRNA en las proteínas en todas las células vivas. Los ribosomas están compuestos de dos subunidades que se fabrican en un proceso complejo llamado ribosoma biogénesis1,2,3,4. Ensamblaje del ribosoma eucariotas se basa en la ayuda de cientos de Asamblea ribosomal esenciales factores2,3,5. Nsa1 (Nop7 asociado 1) es un factor de ensamblaje ribo....
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Protocolo
1. producción de proteínas recombinantes y purificación de Nsa 1
- Diseño de plásmido de expresión Nsa1 y clonación
- Obtener o comprar ADN genómico de S. cerevisiae .
- PCR amplificación de las secuencias diana de Nsa1 (Nsa1FL, residuos 1-463) y c-terminal truncado Nsa1 (Nsa1ΔC, residuos 1-434) con adecuados primers usando ADN genómico aislado de S. cerevisiae y una temperatura de fusión 60 ° C aproximadamente con un tiempo de extensión de 1-2 min. Se utilizaron los siguientes iniciadores para amplificar Nsa1:
SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTT....
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Resultados
Nsa1 fue PCR amplificados de la DNA genomic de S. cerevisiae y subcloned en un vector que contiene una etiqueta de afinidad 6 x-histidina N-terminal seguida de MBP y un sitio de proteasa TEV. Nsa1 se transformó en células de e. coli BL21(DE3) y altos rendimientos de expresión de la proteína se obtuvieron después de la inducción con IPTG y crecimiento a 25 ° C durante la noche (figura 1A). Nsa1 fue purificados por afinidad en la resina de la .......
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Discusión
Mediante este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae se generó para estudios estructurales por cristalografía de rayos x y SAXS. Nsa1 fue bien-se comportó en solución y cristalizado en múltiples formas de cristal. Durante la optimización de estos cristales, se descubrió que el C-terminal de Nsa1 era sensible a la degradación de la proteasa. La alta resolución, forma cristalina ortorrómbica sólo podría ser duplicada con variantes de truncamiento del c-terminal de Nsa1, probablemente porque el C-terminal fl.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Se recogieron datos de difracción en el equipo de acceso colaborativo Regional Sureste (SER-CAT) 22-ID y BM 22 líneas en la avanzada del fotón fuente (APS), laboratorio nacional de Argonne. Los datos SAXS se colectó en la línea de SIBILAS en avance luz fuente (ALS), laboratorio nacional Lawrence Berkeley. Nos gustaría agradecer al personal en la línea de SIBILAS por su ayuda con la recolección remota de datos y procesamiento. Agradecemos a la investigación de espectrometría de masa nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) y grupo de apoyo ayuda para determinar los límites del dominio de la proteína. Este trabajo fue apoyado por el nosotros nacional In....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 vector paralelo | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | Utilizamos una versión modificada de pMBP2 que incluía un N-terminal His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomic | DNA ATCC | 204508D-5 | |
| Primers para la clonación de Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG | |
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTCTTTAGAAGC AGC | |
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG | |
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC | |
| fuerte>Producción y purificación de proteínas recombinantes Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Células estelares | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 y varios truncamientos | Lo et al., 2017 | ||
| Dimensiones moleculares | la selenometionina | MD12-503B | |
| IPTG, sin dioxano | Promega | V3953 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA | Sigma-Aldrich | 4693159001 cloruro | |
| de sodio | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tampón Tris, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glicerol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoetanol | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazol, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Resina de afinidad | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Filtro centrífugo (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Gel de grado de preparación Columna de filtración | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV Proteasa | preparada por NIEHS Expresión de proteínas | Plásmido de expresión central proporcionado por NCI (Tropea et al. Métodos Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad | 456-8056 | ||
| Crystallization, Proteolytic Screening | |||
| Pantalla de cristal | Hampton Research | HR2-110 | |
| Pantalla de cristal 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Pantalla de índice | Hampton Research | HR2-144 | |
| Pantalla PEG/Ion Hampton | Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Dimensiones moleculares | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Dimensiones moleculares | MD15-PS-T | |
| Swissci de 96 pocillos y 3 gotas Placas de caída UVP | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| Cinta de sellado transparente cristalina de 3 pulgadas de ancho | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace | Kit Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Dimensiones | molecularesMD2-100-6 | |
| PEG 400 | Dimensiones moleculares | MD2-100-3 | |
| HEPES/hidróxido de sodio pH 7.5 | Dimensiones moleculares | MD2-011-Citrato de | |
| sodio tribásico | Dimensiones moleculares | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0.22 mm Portaobjetos siliconados | Hampton Research | HR3-231 | |
| Placas de 24 pocillos con sellador (Placa VDX con Sellador) | Hampton Research | HR3-172 | |
| Bucles de nylon montados de 18 mM (0,05 mm a 0,5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Kit de cuentas de semillas | Hampton Research | HR2-320 | |
| Tapas de cristal magnético | Hampton Research | HR4-779 | |
| Varita criogénica magnética | Hampton Research | HR4-729 | |
| Espuma criogénica Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Sistema de disco de cristal | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Faldón completo de 96 pocillos Placa transparente | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Tapete de sellado | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Espectrofotómetro Nanodrop Lite | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Sitios web | |||
| HKL2000 | Otwinoski y Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo y Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrö dinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov y Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
Referencias
- Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
- Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Kressler, D., Hurt, E., Bas....
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Reimpresiones y permisos
